不結球白菜生長發育過程中表型變化作者(zhe)：Ying Tan, Quan Sheng Zhang（張全勝，通訊作者）, Wei Zhao, Zhe Liu, Ming Yu Ma, Ming Yu Zhong, Meng Xin Wang（煙(yan)臺大學海(hai)洋學院）
時間：2019年7月25日
期(qi)刊：Photosynthesis Research
英文標題(ti)：The highly efficient NDH?dependent photosystem I cyclic electron flow pathway in the marine angiosperm Zostera marina
關鍵(jian)字(zi)：環式電子傳遞(di)、NADPH脫(tuo)氫(qing)酶復合(he)體、放氧復合(he)體、跨膜質子梯度、大葉藻
過(guo)(guo)(guo)量輻(fu)射引起的(de)(de)(de)光(guang)合器官的(de)(de)(de)光(guang)氧(yang)化(hua)(hua)損傷(shang)是影(ying)響(xiang)陸生(sheng)(sheng)和(he)(he)海(hai)生(sheng)(sheng)植物(wu)的(de)(de)(de)主要(yao)脅迫因子(zi)之一(yi)(yi)。光(guang)氧(yang)化(hua)(hua)損傷(shang)會破壞ATP和(he)(he)NADPH產生(sheng)(sheng)的(de)(de)(de)化(hua)(hua)學(xue)計量平衡，植物(wu)必須對(dui)ATP和(he)(he)NADPH進行非常精確的(de)(de)(de)動態控制，以維持(chi)高(gao)效的(de)(de)(de)光(guang)合作(zuo)用，滿足植物(wu)不(bu)同的(de)(de)(de)代謝需(xu)求(qiu)。通過(guo)(guo)(guo)調整線(xian)性電子(zi)(LEF)到光(guang)系(xi)統(tong)I循環(huan)電子(zi) (PSI-CEF)的(de)(de)(de)速率，ATP /NADPH比值(zhi)可以被靈活(huo)地(di)調整到所需(xu)的(de)(de)(de)水平。當由兩(liang)個(ge)光(guang)系(xi)統(tong)驅動的(de)(de)(de)LEF從水到NADP+時，O2在氧(yang)進化(hua)(hua)復(fu)合體(ti)(OEC)發生(sheng)(sheng)進化(hua)(hua)，同時產生(sheng)(sheng)NADPH和(he)(he)ATP。作(zuo)為一(yi)(yi)種(zhong)補充機(ji)制，PSI-CEF催化(hua)(hua)電子(zi)從PSI受體(ti)轉(zhuan)移到質(zhi)(zhi)體(ti)醌(PQ)，使光(guang)化(hua)(hua)學(xue)激(ji)發的(de)(de)(de)電子(zi)通過(guo)(guo)(guo)cytb6f復(fu)合物(wu)和(he)(he)PC返(fan)回到PSI，而不(bu)需(xu)要(yao)凈生(sheng)(sheng)成(cheng)任(ren)何(he)基(ji)質(zhi)(zhi)還原劑。在這(zhe)個(ge)過(guo)(guo)(guo)程中，質(zhi)(zhi)子(zi)被從基(ji)質(zhi)(zhi)中取出并泵入到類囊體(ti)腔，產生(sheng)(sheng)了跨類囊體(ti)的(de)(de)(de)質(zhi)(zhi)子(zi)梯度(△pH)，并通過(guo)(guo)(guo)CF0F1-ATP合酶通道驅動ATP合成(cheng)。因此(ci)，PSI-CEF的(de)(de)(de)活(huo)性被認為有助(zhu)于(yu)平衡由光(guang)反應產生(sheng)(sheng)的(de)(de)(de)ATP/NADPH的(de)(de)(de)比例。
在被(bei)子植物中至少提(ti)出了兩種(zhong)備選的(de)(de)(de)(de)(de)PSI-CEF通(tong)路。主要途徑是(shi)涉(she)及質(zhi)(zhi)子梯度調節5 (PGR5)和(he)類PGR5光合(he)(he)(he)(he)(he)顯(xian)型1 (PGRL1)的(de)(de)(de)(de)(de)抗霉素a敏(min)感(gan)途徑。次要途徑是(shi)由對魚(yu)藤(teng)酮敏(min)感(gan)的(de)(de)(de)(de)(de)葉(xie)(xie)(xie)綠(lv)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)NADPH脫氫樣(NDH)復(fu)合(he)(he)(he)(he)(he)物介(jie)導(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)。擬南芥(jie)突(tu)變(bian)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)實驗(yan)發(fa)現PGR5/L1和(he)NDH依賴的(de)(de)(de)(de)(de)循(xun)環電(dian)子傳遞對跨類囊(nang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)膜質(zhi)(zhi)子梯度分別(bie)貢(gong)獻30%和(he)5%。葉(xie)(xie)(xie)綠(lv)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)NDH復(fu)合(he)(he)(he)(he)(he)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)是(shi)位(wei)于類囊(nang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)基(ji)(ji)質(zhi)(zhi)中的(de)(de)(de)(de)(de)一種(zhong)多蛋白復(fu)合(he)(he)(he)(he)(he)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)，最初是(shi)通(tong)過與線粒體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)呼吸電(dian)子傳遞中的(de)(de)(de)(de)(de)復(fu)合(he)(he)(he)(he)(he)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)I同(tong)源(yuan)而(er)發(fa)現的(de)(de)(de)(de)(de)。迄(qi)今(jin)為止，在葉(xie)(xie)(xie)綠(lv)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)NDH復(fu)合(he)(he)(he)(he)(he)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)中共檢測到29個亞(ya)(ya)基(ji)(ji)，其(qi)中包括(kuo)五個亞(ya)(ya)復(fu)合(he)(he)(he)(he)(he)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti):膜亞(ya)(ya)復(fu)合(he)(he)(he)(he)(he)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)、亞(ya)(ya)復(fu)合(he)(he)(he)(he)(he)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)A、亞(ya)(ya)復(fu)合(he)(he)(he)(he)(he)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)B、腔內(nei)亞(ya)(ya)復(fu)合(he)(he)(he)(he)(he)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)和(he)電(dian)子供體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)結合(he)(he)(he)(he)(he)亞(ya)(ya)復(fu)合(he)(he)(he)(he)(he)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)。葉(xie)(xie)(xie)綠(lv)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)NDH復(fu)合(he)(he)(he)(he)(he)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)缺乏氧化NAD(P)H的(de)(de)(de)(de)(de)亞(ya)(ya)基(ji)(ji)，但(dan)有(you)與Fd位(wei)點鏈接的(de)(de)(de)(de)(de)供體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)連接亞(ya)(ya)復(fu)合(he)(he)(he)(he)(he)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)，NAD(P)H將電(dian)子經Fd傳遞給NDH復(fu)合(he)(he)(he)(he)(he)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)繼而(er)還(huan)原PQ庫。
目前(qian)提出了依賴(lai)NDH的(de)(de)(de)(de)(de)PSI-CEF的(de)(de)(de)(de)(de)三個主要功(gong)能(neng)：(1)通過下(xia)(xia)調通過cytb6/f復合(he)(he)(he)(he)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)電(dian)子輸運以酸化(hua)類囊體(ti)腔(qiang)來啟動(dong)光(guang)保護，并在PSII中(zhong)誘導非光(guang)化(hua)學猝滅的(de)(de)(de)(de)(de)qE組(zu)分來消(xiao)散吸(xi)收的(de)(de)(de)(de)(de)多余光(guang)能(neng)；(2)在各(ge)種嚴重脅迫條(tiao)(tiao)件(jian)下(xia)(xia)，通過保持ATP/NADPH的(de)(de)(de)(de)(de)高輸出比(bi)來保護光(guang)合(he)(he)(he)(he)器官免(mian)受(shou)基質過度還原的(de)(de)(de)(de)(de)傷(shang)害；(3)產(chan)生額外的(de)(de)(de)(de)(de)ATP來驅動(dong)蛋白質修(xiu)復，滿足植(zhi)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)各(ge)種代謝需(xu)求(qiu)。然(ran)而，葉(xie)綠體(ti)NDH復合(he)(he)(he)(he)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)生理功(gong)能(neng)可(ke)能(neng)因物(wu)(wu)種、處理條(tiao)(tiao)件(jian)、生長環(huan)境等有所不同(tong)。已有研(yan)究(jiu)表明，NDH依賴(lai)的(de)(de)(de)(de)(de)PSI-CEF損傷(shang)不影(ying)響(xiang)整體(ti)光(guang)合(he)(he)(he)(he)作(zuo)用，說明NDH依賴(lai)的(de)(de)(de)(de)(de)PSI-CEF在穩態光(guang)合(he)(he)(he)(he)作(zuo)用中(zhong)不是必需(xu)的(de)(de)(de)(de)(de)，雖然(ran)它在波動(dong)環(huan)境下(xia)(xia)的(de)(de)(de)(de)(de)光(guang)合(he)(he)(he)(he)調節中(zhong)發揮作(zuo)用。一般認為NDH依賴(lai)的(de)(de)(de)(de)(de)PSI-CEF不參與弱光(guang)條(tiao)(tiao)件(jian)下(xia)(xia)的(de)(de)(de)(de)(de)光(guang)合(he)(he)(he)(he)作(zuo)用，但(dan)最近的(de)(de)(de)(de)(de)一項研(yan)究(jiu)表明，水稻(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)NDH復合(he)(he)(he)(he)體(ti)缺失可(ke)以在弱光(guang)條(tiao)(tiao)件(jian)下(xia)(xia)降低碳(tan)同(tong)化(hua)速(su)率和植(zhi)物(wu)(wu)生物(wu)(wu)量積累。絕大多數的(de)(de)(de)(de)(de)海洋植(zhi)物(wu)(wu)(Peltier和Cournac 2002)，以及一(yi)些(xie)陸生高等植(zhi)(zhi)(zhi)物(wu)(wu)(wu)，如所有(you)種類的(de)(de)球根(gen)植(zhi)(zhi)(zhi)物(wu)(wu)(wu)和松科(ke)植(zhi)(zhi)(zhi)物(wu)(wu)(wu)，以及部(bu)分種類的(de)(de)蘭科(ke)和天竺(zhu)葵科(ke)植(zhi)(zhi)(zhi)物(wu)(wu)(wu)，均(jun)未(wei)檢測到NDH基因編碼(ma)。缺(que)乏(fa)NDH復(fu)合(he)(he)體，表(biao)明該復(fu)合(he)(he)體的(de)(de)功(gong)能(neng)可有(you)可無，可能(neng)存在(zai)一(yi)些(xie)替代或補償的(de)(de)電子傳遞(di)途徑彌補其功(gong)能(neng)。相反，NDH復(fu)合(he)(he)體在(zai)某(mou)些(xie)物(wu)(wu)(wu)種中的(de)(de)存在(zai)可能(neng)提(ti)供一(yi)個(ge)關鍵的(de)(de)選擇優勢，使光合(he)(he)反應能(neng)夠適應環境(jing)壓力。大多數海洋植(zhi)(zhi)(zhi)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)NDH復(fu)合(he)(he)體的(de)(de)缺(que)失可能(neng)與它們相對穩定的(de)(de)海洋棲息(xi)地有(you)關。
大葉藻(zao)屬(Zostera marina, Zosteraceae)，又稱eelgrass，是一(yi)種廣泛分布(bu)的(de)(de)海(hai)草物(wu)種，由陸地單角類(lei)的(de)(de)淡水(shui)祖(zu)先進化而(er)來，并成功地過(guo)渡(du)到完全淹(yan)沒的(de)(de)海(hai)洋分類(lei)單元。在(zai)進化過(guo)程中，基因組的(de)(de)缺(que)失和擴增現象頻繁發生，為其海(hai)洋生活(huo)方(fang)式所需的(de)(de)結構(gou)和生理(li)適應提供了遺傳變異。根據(ju)氨基酸(suan)序列的(de)(de)多重比對，發現大葉藻(zao)具(ju)有完整的(de)(de)29個(ge)編碼葉綠體(ti)NDH亞(ya)基的(de)(de)基因，即使在(zai)海(hai)洋被子植物(wu)中也很少見。分類(lei)與大葉藻(zao)同(tong)目的(de)(de)波喜蕩(dang)草屬（Posidonia）和(he)根枝草屬（Amphibolis）未檢(jian)測到編碼葉綠(lv)體(ti)NDH復(fu)合體(ti)的(de)基因(yin)(yin)。因(yin)(yin)此(ci)，葉綠(lv)體(ti)NDH復(fu)合體(ti)在Z. marina的(de)作用(yong)需(xu)要探索。在本文中，我們提出了在Z. marina中高效的NDH依賴的PSI-CEF，這可能與OEC失活以及光合性能的維持有關。此外，我們提供的證據表明，在過量輻照下依賴NDH和依賴PGR5/Li的PSI-CEF之間存在此消彼長的動態變化。
—— 材料和方法 ——
植物材料
在(zai)位(wei)于中(zhong)國山東半島(dao)北側的(de)榮(rong)成(37°16′N, 122°41′E)3 m深(shen)度的(de)次潮汐海(hai)草床上采(cai)(cai)集到根(gen)莖系統完整(6-9節間)的(de)健康大葉藻。在(zai)2019年(nian)5月(yue)連(lian)續幾(ji)天(tian)的(de)下午晚些時候(hou)進行采(cai)(cai)樣。大葉藻在(zai)實驗前在(zai)過(guo)濾海(hai)水水族(zu)館預培養(yang)3天(tian)，在(zai)15℃和100μmolm-2s-1，以(yi)10:14-h的(de)光：暗(an)周期進行照明(ming)。根(gen)據最小飽和光強度，照明(ming)由(you)A型LED燈提供，色溫范圍6000 K。從(cong)葉鞘上方2厘米(mi)處采(cai)(cai)集葉片進行實驗測量(liang)，以(yi)保持相同的(de)年(nian)齡。
進化分析(xi)
基于29個NDH亞單位的(de)(de)串(chuan)聯序列(lie)，采用MEGA 5.0程序構(gou)建系(xi)統(tong)發育樹，并進(jin)行(xing)(xing)了1000次重復的(de)(de)bootstrap測試(shi)。這30個物(wu)種的(de)(de)所有這些序列(lie)都是通過(guo)BLASTP分(fen)析從國家生(sheng)物(wu)技(ji)術信息中心(NCBI)檢索到的(de)(de)。交互(hu)式生(sheng)命樹(// url .embl.de/)用于對樹進(jin)行(xing)(xing)注釋和修飾。
光(guang)處理(li)和抑(yi)制劑處理(li)
暗(an)(an)適應過夜的(de)(de)(de)(de)大葉藻暴露(lu)在(zai)三種不同的(de)(de)(de)(de)光(guang)(guang)(guang)(guang)強度(du)，50,300和600μmolm-2s - 1反應3小(xiao)時。這些處(chu)理(li)在(zai)下(xia)文稱為(wei)弱光(guang)(guang)(guang)(guang)（LL）、中光(guang)(guang)(guang)(guang)（ML）和強光(guang)(guang)(guang)(guang)（HL），它們通過德(de)國DUAL-PAM-100來測量最小(xiao)飽和光(guang)(guang)(guang)(guang)強來確定(ding)。所有處(chu)理(li)均在(zai)光(guang)(guang)(guang)(guang)照培養箱(GZP-250N，上海森(sen)欣實驗(yan)儀器有限(xian)公司)中進(jin)行(xing)，控(kong)制海水溫度(du)為(wei)15℃，模擬(ni)其(qi)在(zai)自然環境中的(de)(de)(de)(de)生長狀態。光(guang)(guang)(guang)(guang)由A型(xing)LED燈提供，色溫范(fan)圍6000 K。在(zai)測定(ding)熒光(guang)(guang)(guang)(guang)動(dong)力學(xue)之前(qian)，隨機(ji)選(xuan)取暴露(lu)于(yu)光(guang)(guang)(guang)(guang)照下(xia)的(de)(de)(de)(de)葉片，每隔20分鐘至暗(an)(an)適應15分鐘。Antimycin A (AA, Sigma)和rotenone (Aldrich)分別用(yong)于(yu)抑制PGR5/L1和NDH依賴(lai)的(de)(de)(de)(de)PSI-CEF。分別以甲醇(chun)和二甲亞砜為(wei)溶(rong)劑，制備了AA和魚藤(teng)酮原液。處(chu)理(li)后樣品的(de)(de)(de)(de)溶(rong)劑濃度(du)低于(yu)1% (v/v)。葉片使(shi)用(yong)過濾海水或含1μM AA, 150μM魚藤(teng)酮的(de)(de)(de)(de)海水進(jin)行(xing)飽和，并在(zai)光(guang)(guang)(guang)(guang)處(chu)理(li)之前(qian)，在(zai)15℃的(de)(de)(de)(de)黑暗(an)(an)條(tiao)件下(xia)孵育葉片1 h。
葉綠(lv)素A熒光和P700測定(ding)
利用DUAL-PAM-100測(ce)量系統(tong)同時測(ce)量葉綠(lv)素a熒(ying)光和(he)P700+吸(xi)光度(du)變(bian)化(hua)。在微弱的調制光下(xia)（5μmol m-2s-1）測量出最(zui)小熒光(guang)(guang)(guang)(guang)值(zhi)（Fo）后(hou)，分別對暗適應(ying)和光(guang)(guang)(guang)(guang)適應(ying)條件下的(de)(de)葉片在(zai)(zai)(zai)(zai)300ms的(de)(de)飽(bao)和脈沖光(guang)(guang)(guang)(guang)下（16000μmol m-2 s-1）測量Fm和Fm’。Fs是光(guang)(guang)(guang)(guang)照(zhao)條件下的(de)(de)穩態熒光(guang)(guang)(guang)(guang)值(zhi)。P700+的(de)(de)信號會在(zai)(zai)(zai)(zai)最(zui)小（完全(quan)還原）和最(zui)大(da)（完全(quan)氧(yang)化(hua)）之間變(bian)化(hua)。最(zui)大(da)的(de)(de)變(bian)化(hua)在(zai)(zai)(zai)(zai)P700完全(quan)氧(yang)化(hua)狀態(Pm)和一個給定的(de)(de)光(guang)(guang)(guang)(guang)狀態(Pm’)是在(zai)(zai)(zai)(zai)遠紅光(guang)(guang)(guang)(guang)(250μmol m? 2 s?1)和光(guang)(guang)(guang)(guang)化(hua)光(guang)(guang)(guang)(guang)（127μmol m? 2 s?1）預照(zhao)射后(hou)由飽(bao)和脈沖光(guang)(guang)(guang)(guang)測量。PSII的(de)(de)最(zui)大(da)光(guang)(guang)(guang)(guang)量子產量：Fv/Fm = (Fm ? Fo)/Fm，PSII的(de)(de)電(dian)子傳遞速(su)率：ETRII = 0.84 × PPDF × 0.5 ×( -Fm’—Fs)∕Fm’，PSI的(de)(de)電(dian)子傳遞速(su)率：0.84 × PPDF × 0.5 ×( -Pm’—P)/Pm，PSI-CEF：ETRI-ETRII。
暗(an)適應(ying)樣品在(zai)光化(hua)光下照射2min，在(zai)關閉(bi)AL后，我(wo)們監測(ce)了隨后葉綠素熒光的(de)瞬時增加(jia)作為NDH活性的(de)一(yi)個指(zhi)標，關閉(bi)AL后10 s內測(ce)定鼓(gu)包的(de)初始斜率。根據(ju)Li等人的方法，在暗適應葉片(pian)中，當光(guang)誘導吸光(guang)度在830nm處發生變化時，監測(ce)P700+的還原動力學。我們測量(liang)P700的再次(ci)還(huan)原之(zhi)前采用一個專用校準程序對P700信號進行歸(gui)一化處(chu)理。遠(yuan)紅光照(zhao)射(she)后10 s內測定P700+再還(huan)原半衰(shuai)期縮短(t1/2)，表明PSI-CEF活性升高。
快速OJIP熒(ying)光瞬態測量
利用多功能植(zhi)物效率分(fen)析法測(ce)定葉綠素熒(ying)光(guang)快速誘(you)導曲線。由曲線得到如(ru)下數據：20 μs的(de)(de)最(zui)小熒(ying)光(guang)值（Fo），最(zui)大熒(ying)光(guang)值（Fm），0.3ms的(de)(de)熒(ying)光(guang)值（K-step，Fk），3ms的(de)(de)熒(ying)光(guang)值（J-step，Fj），30ms的(de)(de)熒(ying)光(guang)值（I-step，Fi）。為了(le)評價(jia)PSII的(de)(de)活性，計算了(le)PSII從光(guang)子(zi)(zi)吸(xi)收到系(xi)統間電子(zi)(zi)受體(ti)減少的(de)(de)能量守恒性能指數(勢)：PIABS=4 ×(Fk ? Fo) × Fm × (Fm ? FJ)/Fv × (FJ ? Fo)2，作為PSII供體(ti)側指標監(jian)測(ce)的(de)(de)k步歸(gui)一化可變熒(ying)光(guang)被計算為WK = (Fk?Fo)/(FJ?Fo)。
ECS分析
電致(zhi)變(bian)色效應吸光(guang)度(du)信號變(bian)化(hua)的(de)測量是用(yong)DUAL-PAM-100的(de)P515/535模塊在515nm波長(chang)下進行(xing)監測。樣品先暗適應15min，再在127μmolm-2s-1的(de)光化(hua)光下照射5min，然后再進行(xing)測量。AL被(bei)關閉，記錄ECS的(de)衰變動(dong)力學(xue)，以確定總(zong)ECS，代表了總(zong)質子動(dong)能(pmf)的(de)大(da)小及(ji)其組成部分，即ΔpH和Δψ。ECS衰減(jian)(gH+)是通過最(zui)初的(de)300ms響(xiang)應速率到P515發射結(jie)束來(lai)估計的(de)。
免疫印跡分析
從處理的(de)(de)(de)(de)葉(xie)片中(zhong)分(fen)(fen)離出葉(xie)綠(lv)體(ti)按照(zhao)是廠(chang)家(jia)的(de)(de)(de)(de)指(zhi)導(dao)使用(yong)Plants Leaf Chloroplast Rude Divide Kit測(ce)量(liang)。葉(xie)綠(lv)素含量(liang)測(ce)定采用(yong)Porra等人的(de)(de)(de)(de)方法(fa)。根(gen)據Towbin等人的(de)(de)(de)(de)描述，對NdhH、NdhS、PGR5、PGRL1、PsbO、PsbP和PsbQ(Agrisera，瑞典(dian))的(de)(de)(de)(de)抗體(ti)進(jin)行(xing)Westernblot分(fen)(fen)析。采用(yong)Rubisco大亞單位抗體(ti)(RbcL, Agrisera，瑞典(dian))作為內參對照(zhao)。用(yong)凝膠對x射(she)線(xian)膠片上(shang)產生的(de)(de)(de)(de)化學發(fa)光帶(dai)進(jin)行(xing)密(mi)(mi)度測(ce)量(liang)使用(yong)圖像實驗室軟(ruan)件對Doc XR+系統(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)進(jin)行(xing)量(liang)化。每個目標條帶(dai)的(de)(de)(de)(de)總密(mi)(mi)度都是基于RbcL密(mi)(mi)度進(jin)行(xing)標準(zhun)化的(de)(de)(de)(de)。
數據分(fen)析
采(cai)用(yong)SPSS 22.0統(tong)計軟(ruan)件包進(jin)行統(tong)計分(fen)析(xi)。所有參數均采(cai)用(yong)單因素方差(cha)分(fen)析(xi)。采(cai)用(yong)Tukey趨勢檢驗進(jin)行事后比較。差(cha)異(yi)有統(tong)計學意義P < 0.05。使用(yong)Origin9.0程序，采(cai)用(yong)單指(zhi)數函數擬(ni)合法對P700+再還原的每個點進(jin)行擬(ni)合。使用(yong)線性回歸分(fen)析(xi)來評(ping)估WK，PIABS，和鼓包。
—— 結果 ——
NDH復合體的系統發生分析
基(ji)于連接的29個NDH亞(ya)基(ji)序(xu)(xu)列構建(jian)了(le)葉綠體(ti)(ti)NDH復(fu)(fu)合(he)體(ti)(ti)的系統(tong)發生樹，顯(xian)示了(le)NDH復(fu)(fu)合(he)序(xu)(xu)列在藍(lan)藻(zao)(zao)、苔蘚、蕨類(lei)(lei)、蕨類(lei)(lei)和石生植物(wu)中(zhong)NDH復(fu)(fu)合(he)體(ti)(ti)的系統(tong)發育(yu)關系。在藍(lan)藻(zao)(zao)門，輪藻(zao)(zao)門和蕨類(lei)(lei)植物(wu)NDH復(fu)(fu)合(he)物(wu)均(jun)不完整(zheng)，并且部(bu)分(fen)被子(zi)植物(wu)中(zhong)也缺失部(bu)分(fen)NDH亞(ya)基(ji)的。Z.marina包含五個完整(zheng)的NDH亞(ya)復(fu)(fu)合(he)物(wu)。海洋植物(wu)中(zhong)除了(le)原始藻(zao)(zao)類(lei)(lei)之外(wai)，綠藻(zao)(zao)、硅藻(zao)(zao)、紅(hong)藻(zao)(zao)和褐藻(zao)(zao)等(deng)常見藻(zao)(zao)類(lei)(lei)都缺少編(bian)碼葉綠體(ti)(ti)NDH復(fu)(fu)合(he)體(ti)(ti)亞(ya)基(ji)的同源(yuan)基(ji)因，這表(biao)明Z. marina中(zhong)NDH復(fu)(fu)合(he)體(ti)(ti)的存在可能(neng)在光合(he)作用中(zhong)發揮重要作用。
圖1 葉綠體NDH復合(he)體的系統發生樹
PSI循環電(dian)子(zi)流的動態變(bian)化(hua)
以ETRI-ERTII為代(dai)表的(de)(de)(de)PSI-CEF的(de)(de)(de)活性在三個水平的(de)(de)(de)照(zhao)射下逐(zhu)漸增加。同樣，P700+再誘導(dao)所示的(de)(de)(de)PSI-CEF活性也(ye)隨著光(guang)強(qiang)(qiang)的(de)(de)(de)升(sheng)高而逐(zhu)漸升(sheng)高。這(zhe)些(xie)結果表明，大葉藻(zao)PSI-CEF隨著光(guang)照(zhao)時間的(de)(de)(de)延長逐(zhu)漸增強(qiang)(qiang)，同時也(ye)會(hui)隨著光(guang)照(zhao)強(qiang)(qiang)度(du)的(de)(de)(de)增強(qiang)(qiang)而增強(qiang)(qiang)。
圖2 在LL（50μmolm-2s – 1 黑(hei)色(se)圓形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑(hei)色(se)方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑(hei)色(se)三角）處(chu)理(li)條件(jian)下ETRI-ETRII隨(sui)時間的變(bian)化過程(cheng)。平均值±SD由(you)四個獨立樣本計(ji)算(suan)。采(cai)用Tukey趨勢檢驗，差異(yi)有統計(ji)學意(yi)義(P < 0.05)
圖3 a在LL（50μmolm-2s – 1 黑色圓形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三(san)角）處理條件(jian)下(xia)P700+再還原半衰期隨時(shi)間(jian)的(de)變化過程。平均值(zhi)±SD由四(si)個(ge)獨立樣本計算。每個(ge)點表示(shi)對指數函(han)數的(de)擬合（所(suo)有R2值(zhi)＞0.96）
兩個(ge)PSI循環電子途徑的動態變化
利用光(guang)(guang)照(zhao)(zhao)(zhao)后(hou)葉綠素(su)熒光(guang)(guang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)瞬(shun)時增(zeng)強(qiang)來(lai)測定NDH依(yi)賴(lai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)PSI-CEF。如圖(tu)4a所示(shi)，葉綠素(su)熒光(guang)(guang)在光(guang)(guang)照(zhao)(zhao)(zhao)后(hou)出現了明(ming)顯的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)瞬(shun)時增(zeng)強(qiang)，且這(zhe)種(zhong)增(zeng)強(qiang)在HL條件下大(da)于ML大(da)于LL光(guang)(guang)照(zhao)(zhao)(zhao)處理。此外，光(guang)(guang)照(zhao)(zhao)(zhao)后(hou)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)初始(shi)斜率隨著曝光(guang)(guang)時間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)增(zeng)加(jia)而逐漸增(zeng)大(da)(圖(tu)4c)，說明(ming)NDH依(yi)賴(lai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)PSI-CEF被顯著激活(huo)。為了確定處理過量照(zhao)(zhao)(zhao)射的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)兩(liang)個PSI-CEF通(tong)路(lu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)持續響應，我們使(shi)用從(cong)Z. marina葉子中分(fen)離的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)葉綠體，使(shi)用特異性(xing)抗體進行免(mian)疫印跡分(fen)析。針對NdhH亞(ya)基的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)抗體只能識別(bie)(bie)45kDa的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)個多(duo)肽，而抗NdhS的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)抗體只能識別(bie)(bie)27-kda的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)個蛋白。每個樣本中，anti-PGR5識別(bie)(bie)一(yi)個15-kda蛋白，anti-PGRL1識別(bie)(bie)一(yi)個29-kda蛋白（圖(tu)5）。光(guang)(guang)密(mi)度(du)分(fen)析顯示(shi)，NdhH和(he)NdhS蛋白水(shui)平所描述的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)ndh依(yi)賴(lai)通(tong)路(lu)活(huo)性(xing)明(ming)顯隨暴(bao)露時間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)延長而逐漸增(zeng)加(jia)。相比之下，由PGR5和(he)PGRL1蛋白水(shui)平表達(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)PGR5/L1相關的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)通(tong)路(lu)活(huo)性(xing)在光(guang)(guang)照(zhao)(zhao)(zhao)開始(shi)后(hou)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)早期最高，隨后(hou)下降到穩(wen)定水(shui)平(圖(tu)5b)，表明(ming)PGR5 /l1依(yi)賴(lai)和(he)nndh依(yi)賴(lai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)PSI-CEF通(tong)路(lu)可能在不同的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)光(guang)(guang)照(zhao)(zhao)(zhao)期交替作用。
圖4 a一(yi)種監測NDH活性的經典葉綠素熒光追蹤，b在(zai)LL（50μmolm-2 s– 1 黑色(se)圓形(xing)）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色(se)方形(xing)）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色(se)三角）條(tiao)件下(xia)照射(she)3h后鼓(gu)(gu)包的響應。b在(zai)LL（50μmolm-2 s– 1 黑色(se)圓形(xing)）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色(se)方形(xing)）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色(se)三角）條(tiao)件下(xia)鼓(gu)(gu)包的初始(shi)斜率隨時間(jian)的變化過程。平均值±SD由(you)四個獨立樣本(ben)計(ji)算(suan)。采用T檢(jian)驗，差異(yi)有統(tong)計(ji)學意義(yi)(P < 0.05)
