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Ampha Z32阻抗流式細胞儀在小麥孢子發育及產胚量早期預測中的應用
日期：2020-09-23 10:47:50
單倍體育種作為育種的核心生物技術之一，具有快速純合基因、縮短育種年限、提高育種效率等優勢。這項技術是基于對處于發育特定階段的小孢子在進行脅迫處理，可使小孢子的配子體途徑發生重編程轉向孢子體途徑，從而產生胚胎。在整個發育過程中，雄配子體誘導的產胚率受許多因素的影響，如供體植株的質量和生理狀態、自身基因型、小孢子發育階段、脅迫誘導預處理和培養條件等，因此如何提高雄配子體誘導的產胚率是這項技術成功的關鍵。
在過去十年中，研究者通常利用染色法和顯微鏡鏡檢來研究小孢子胚性發育并進行產胚量的預測，由于染色法不具備通用性，不同的物種需要選擇不同的染色劑，導致整個測試過程繁瑣且費時、耗力。因此，亟需一種可以簡單、快速、可靠檢測小孢子胚性發育階段的無創檢測工具。有研究報道，Ampha Z32阻抗流式細胞儀（IFC）基于細胞介電特性可檢測細胞的大小及活性，已應用于細菌活性、酵母大小，腫瘤細胞的分化、凋亡和壞死等多項研究中。本研究利用Ampha Z32阻抗流式細胞儀（IFC），進行了：（i）離體培養細胞活力的常規監測；（ii）脅迫處理效率的測定；（iii）小孢子懸浮液中產胚量的早期預測，探討了小麥小孢子離體培養過程中發生不同發育途徑的可能性。研究表明，IFC技術可以很好的描述細胞懸浮液中所有小孢子的發育途徑，包括胚性小孢子和花粉小孢子，可以簡單快速準確的評估脅迫處理的效率，并在小麥雄核發育的早期（離體培養的前7天內）進行產胚量的可靠預測。圖1 IFC法判別小孢子懸浮液（培養1天）中活細胞和死細胞
（A）為(wei)熱處理后(hou)小孢(bao)子懸(xuan)(xuan)浮液散(san)點(dian)圖(tu)；（B）為(wei)未處理小孢(bao)子懸(xuan)(xuan)浮液散(san)點(dian)圖(tu)；振幅代表細(xi)胞大小，相位角代表細(xi)胞活性(xing)；（C）為(wei)IFC法(fa)與染色(se)法(fa)相關性(xing)比較（P＜5；=0.9922，n=15）
圖2 Pavon小麥配子體和孢子體途徑的發育階段（IFC法）配子體途徑：ML：單核中晚期；EB：早期雙核；LB：單核晚期；ET：三核早期；LT：三核晚期。孢子體途徑：顯示了培養前21天、培養第0、1、5和7天的小孢子發育狀態。ML/D-21代表配子體發育和孢子體發育的共同階段，紅色垂直門控右側為活性細胞，藍色多邊形門控P1為雄核發育開始時的活性孢子群；綠色多邊形門控P2為孢子離體培養前（D0）的活性孢子群；紫色多邊形門控P3為離體培養1天后的活性孢子群。P1、P2、P3三個孢子群精準描繪出雄核發育過程的三個階段。圖3 Pavon小(xiao)麥配子體(ti)和孢子體(ti)途徑的(de)發育階段（顯微鏡）熒(ying)光DAPI染色后，使(shi)用可見光顯微鏡觀察(cha)小(xiao)孢(bao)(bao)(bao)子：（A）單核(he)(he)(he)小(xiao)孢(bao)(bao)(bao)子；（B）雙核(he)(he)(he)小(xiao)孢(bao)(bao)(bao)子；（C）花粉粒；（D）星形小(xiao)孢(bao)(bao)(bao)子（v為液泡）；（E）多核(he)(he)(he)小(xiao)孢(bao)(bao)(bao)子；（F）質膜(mo)化小(xiao)孢(bao)(bao)(bao)子。比例尺＝20μm。圖4 P1、P2、P3三個小孢子類群的振幅和相位角中值數本次實驗分別在培養前21天、培養第0天和第5天用IFC法檢測了不少于5個小孢子懸浮液，并分別分析了每個懸浮液中P1、P2和P3類群中小孢子的活性（振幅A圖）和大小（相位角B圖）。每個點代表每個類群內小孢子的數量。Tukey檢驗表明，不同培養天數下，不同類群內的孢子數量沒有顯著變化（p<0.05），進而說明IFC法可以精準描繪出雄核發育過程。圖(tu)6 IFC法與顯微鏡(jing)鏡(jing)檢結果的比較(jiao)圖7 Pavon小(xiao)麥小(xiao)孢子培(pei)養早期的產胚量預測（IFC法）本實驗利用培養第7天的小孢子懸浮液中P3類群的小孢子的存活率并與產胚量進行了相關性分析，所得線性方程為：y=6.539x-20.827；=0.9519，p<0.05 。結果表明，IFC法可以在小孢子培養早期進行產胚量的準確預測。綜上所述，Ampha Z32阻抗流式細胞儀（IFC）是一個能夠簡單快速追蹤小孢子的發育狀態、評價脅迫處理效率、進行產胚量早期預測的可靠測量工具。Canonge J, Philippot M, Leblanc C, et al. Impedance flow cytometry allows the early prediction of embryo yields in wheat (Triticum aestivum L.) microspore cultures. Plant Science, 2020, 300: 110586.
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