甜菜孢囊線(xian)蟲(chong)（Heterodera schachtii）是全世界重要的檢疫性有(you)害生物，對(dui)甜菜具有(you)毀滅性危害。1850 年(nian)德國首次報(bao)道該線蟲(chong)(Franklin ＆ Heterodera, 1972) 。到目(mu)前為止，該線蟲(chong)已在全世界(jie)的美(mei)洲(zhou)、歐洲(zhou)、亞洲(zhou)等50多個國家(jia)或地區有分布，20多個國家(jia)將(jiang)該線蟲(chong)列為檢疫(yi)對象(Steele, 1984) 。甜菜(cai)(cai)孢囊線蟲是甜菜(cai)(cai)上危(wei)害最嚴(yan)重的病原(yuan)生物(wu)之一，可導致甜菜(cai)(cai)產量損失25%～50%，每年(nian)造成超過(guo)150億美元的經濟損失 (Singh et al., 2015)。篩選土壤樣本以定性和定量地評估線蟲感染是一項預防措施，也是農業害蟲管理策略的一個組成部分。
甜菜孢(bao)(bao)(bao)囊(nang)線(xian)(xian)蟲(chong)以(yi)(yi)(yi)卵的(de)(de)(de)形(xing)式(shi)在土(tu)壤中可以(yi)(yi)(yi)存活(huo)多年，孢(bao)(bao)(bao)囊(nang)是(shi)(shi)由雌性(xing)線(xian)(xian)蟲(chong)的(de)(de)(de)遺骸形(xing)成(cheng)的(de)(de)(de)保護性(xing)外(wai)殼(ke)。雌性(xing)線(xian)(xian)蟲(chong)死亡后，其體壁變硬，形(xing)成(cheng)棕(zong)色的(de)(de)(de)硬化(hua)孢(bao)(bao)(bao)囊(nang)。量化(hua)線(xian)(xian)蟲(chong)感染(ran)的(de)(de)(de)能力是(shi)(shi)針(zhen)對線(xian)(xian)蟲(chong)的(de)(de)(de)控制措施以(yi)(yi)(yi)及開發抗(kang)線(xian)(xian)蟲(chong)植物(wu)育(yu)種(zhong)系的(de)(de)(de)先決(jue)條件。可以(yi)(yi)(yi)通過孢(bao)(bao)(bao)囊(nang)計(ji)數(shu)來估計(ji)線(xian)(xian)蟲(chong)種(zhong)群密(mi)度(du)。孢(bao)(bao)(bao)囊(nang)需要(yao)從含(han)有(you)有(you)機碎片的(de)(de)(de)土(tu)壤樣品中手工挑選(xuan)，其中碎片的(de)(de)(de)數(shu)量取決(jue)于(yu)樣品提取方法。手動(dong)計(ji)數(shu)是(shi)(shi)一項耗時(shi)的(de)(de)(de)任(ren)務，計(ji)數(shu)準確性(xing)受到主(zhu)觀決(jue)策、持續專(zhuan)注的(de)(de)(de)能力以(yi)(yi)(yi)及將孢(bao)(bao)(bao)囊(nang)與其他顆粒(li)分離的(de)(de)(de)經(jing)驗的(de)(de)(de)影響。因此(ci)，只有(you)自動(dong)計(ji)數(shu)才(cai)適用于(yu)高(gao)通量應用。雖然線(xian)(xian)蟲(chong)的(de)(de)(de)數(shu)量是(shi)(shi)一項重要(yao)的(de)(de)(de)定(ding)量衡量標準，但表(biao)型特征（例如(ru)孢(bao)(bao)(bao)囊(nang)的(de)(de)(de)大(da)小、形(xing)狀和顏(yan)色）也是(shi)(shi)相(xiang)關的(de)(de)(de)。研究(jiu)顯示，孢(bao)(bao)(bao)囊(nang)大(da)小的(de)(de)(de)增(zeng)加是(shi)(shi)馬鈴(ling)薯孢(bao)(bao)(bao)囊(nang)線(xian)(xian)蟲(chong)種(zhong)群適應植物(wu)抗(kang)性(xing)的(de)(de)(de)指標（Fournet et al., 2016），這表明孢囊(nang)表型與抗性相(xiang)關。雖然其他(ta)數據(ju)模式，例如遺(yi)傳數據(ju)，也可以應用于估(gu)計線蟲感(gan)染(ran)（Bogale et al., 2020），但只有圖像數據可(ke)用于(yu)表征孢囊的表型。
本文(wen)介紹了一種(zhong)基于計算機視(shi)覺的高(gao)通量(liang)系統，該(gai)系統可(ke)以量(liang)化甜菜孢囊(nang)線蟲感(gan)染并(bing)測量(liang)孢囊(nang)的表型特征。在標(biao)準化環境中記(ji)錄土(tu)(tu)壤樣本提取(qu)物的(de)(de)顯微圖(tu)(tu)像(xiang)后，實(shi)例分(fen)割算法用于檢測這些圖(tu)(tu)像(xiang)中的(de)(de)線蟲(chong)孢囊。在一項使用已知孢囊數(shu)量的(de)(de)真實(shi)樣本和人(ren)工注釋圖(tu)(tu)像(xiang)的(de)(de)評估(gu)中，計(ji)算機(ji)視覺方(fang)法產(chan)生了準確的(de)(de)線蟲(chong)孢囊計(ji)數(shu)以及準確的(de)(de)孢囊分(fen)割。基于這樣的(de)(de)分(fen)割，可以計(ji)算出(chu)孢囊特(te)征，以揭示不同土(tu)(tu)壤中線蟲(chong)種(zhong)群之間的(de)(de)表型差(cha)異，以及甜菜種(zhong)植前(qian)后觀察到的(de)(de)種(zhong)群。計(ji)算(suan)機視(shi)覺方法不僅能(neng)夠(gou)快(kuai)速準確地計(ji)數(shu)孢囊，而且能(neng)夠(gou)在不同條件下對(dui)孢囊特(te)征(zheng)進行(xing)表型(xing)分析(xi)，為(wei)農業和植物育種研(yan)究中的高通量應用提供了基礎(chu)。源代(dai)碼和帶注釋的(de)圖像數(shu)據集可供科學使用，通過額(e)外的(de)訓練數(shu)據，該系(xi)統也可以推(tui)廣到其他線蟲(chong)種(zhong)類。
土(tu)壤樣本取自已知具(ju)有甜菜孢囊線蟲(chong)感染歷史(shi)的土(tu)地(di)。通過網篩組合（2 mm和100 μm）制(zhi)備(bei)用(yong)于圖像采集的(de)土壤提(ti)取物(wu)。隨后，通過離心浮選技術從篩選的(de)土壤提(ti)取物(wu)中(zhong)提(ti)取孢囊(nang)。將孢囊(nang)與(yu)剩余(yu)的(de)有機物(wu)部(bu)分一(yi)起(qi)收集在白色濾紙上，以備(bei)成(cheng)像使(shi)用(yong)。樣(yang)品圖(tu)像由(you)德國LemnaTec提供(gong)的(de)PhenoAIxpert HM記錄(lu)（圖(tu)S1）。它由(you)一(yi)個(ge)工業RGB相機(ji)(ji)和高倍物(wu)鏡系(xi)(xi)統(tong)組成。該系(xi)(xi)統(tong)安(an)裝在物(wu)體上方 35 cm處，視野為 35 × 25 mm。圍繞樣(yang)(yang)(yang)品臺(tai)布(bu)置的水平(ping)定向LED（4000 K）作(zuo)為照明光源。所有組件都安(an)裝在不透明的機(ji)(ji)柜內(nei)，以保護它們免受外部光線的影響。在PhenoAIxpert HM原型機(ji)(ji)中(zhong)，樣(yang)(yang)(yang)品臺(tai)由(you)一(yi)個(ge)樣(yang)(yang)(yang)品架組成，該樣(yang)(yang)(yang)品架可以手動移動到預定義的位(wei)置，以便(bian)執行樣(yang)(yang)(yang)品的一(yi)系(xi)(xi)列成像(xiang)。圖(tu)像(xiang)采集由(you)控制計算機(ji)(ji)手動觸發。將(jiang)來，樣(yang)(yang)(yang)品臺(tai)將(jiang)被(bei)電動X-Y工作(zuo)臺(tai)取代，然后自動將(jiang)樣(yang)(yang)(yang)品移動到預定義位(wei)置并以同步方式觸發圖(tu)像(xiang)采集。
圖S1 PhenoAIxpert HM將(jiang)由德國LemnaTec作為(wei)商業產品推出（HM：High Magnification）
圖1 用于(yu)線蟲孢囊分割的計算機視覺流程(cheng)
表1 用(yong)于孢囊計數驗證的樣本
圖2 手動孢囊計(ji)數與自動孢囊計(ji)數的(de)比較
在所有土壤樣本類(lei)型中，手動(dong)孢囊(nang)(nang)計(ji)(ji)數(shu)與(yu)自動(dong)孢囊(nang)(nang)計(ji)(ji)數(shu)相(xiang)似（圖(tu)2A），無(wu)論(lun)孢囊(nang)(nang)與(yu)有機碎(sui)(sui)片混合(he)（“碎(sui)(sui)屑”）還是孢囊(nang)(nang)與(yu)有機碎(sui)(sui)片分離（“干凈(jing)”）。手動(dong)計(ji)(ji)數(shu)和自動(dong)計(ji)(ji)數(shu)相(xiang)關(guan)性的(de)皮爾(er)遜(xun)相(xiang)關(guan)系數(shu)很(hen)高，“干凈(jing)”為0.981，“碎(sui)(sui)屑”為0.975（圖(tu)2B），表(biao)明使用自動方法可以可靠地估計孢囊的相對數量。
圖3 手動孢囊分割(ge)與自動孢囊分割(ge)的(de)比較(jiao)
圖(tu)4 線蟲孢(bao)(bao)囊表型(xing)特征的分布(bu)（孢(bao)(bao)囊大小和長寬比）
—— 原(yuan)文 ——
Chen L, Daub M, Luigs HG, et al. . Frontiers in Plant Science, 2022, 13: 965254.
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