海(hai)(hai)洋(yang)微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)無處(chu)不(bu)在(zai)，通過光合作(zuo)用和(he)(he)(he)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)地(di)球化學循(xun)環等關(guan)鍵過程，在(zai)海(hai)(hai)洋(yang)中發揮著基(ji)本(ben)作(zuo)用。由于(yu)其很高的(de)(de)(de)(de)更替頻率(lv)和(he)(he)(he)不(bu)完整(zheng)的(de)(de)(de)(de)分布(bu)，監(jian)(jian)測時(shi)(shi)需要(yao)在(zai)正確的(de)(de)(de)(de)時(shi)(shi)間和(he)(he)(he)空間取樣(yang)。使(shi)用兩個在(zai)線(xian)流式(shi)細(xi)胞儀系統對(dui)那不(bu)勒(le)斯灣沿(yan)岸(an)地(di)區(qu)(qu)的(de)(de)(de)(de)海(hai)(hai)洋(yang)微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)進行了(le)監(jian)(jian)測，驗(yan)證一(yi)(yi)種新(xin)的(de)(de)(de)(de)概念，證明該(gai)技術可以(yi)作(zuo)為(wei)一(yi)(yi)個實時(shi)(shi)水質報警(jing)系統的(de)(de)(de)(de)有(you)用工具(ju)。建議將(jiang)細(xi)菌和(he)(he)(he)微(wei)型(xing)浮游植物(wu)(wu)濃度(du)(du)作(zuo)為(wei)水質的(de)(de)(de)(de)一(yi)(yi)般(ban)指(zhi)標(biao)，這是(shi)評估環境條件變化的(de)(de)(de)(de)影響所(suo)(suo)必(bi)需的(de)(de)(de)(de)第一(yi)(yi)步，隨后(hou)將(jiang)深入(ru)分析群落組成(cheng)是(shi)否存在(zai)病(bing)原體或其他指(zhi)標(biao)。在(zai)調查(cha)期間，我們發現在(zai)未經處(chu)理的(de)(de)(de)(de)城市廢物(wu)(wu)排放區(qu)(qu)或河(he)流輸入(ru)區(qu)(qu)細(xi)菌濃度(du)(du)高。一(yi)(yi)般(ban)說來，細(xi)菌的(de)(de)(de)(de)豐(feng)度(du)(du)與鹽度(du)(du)呈(cheng)負相關(guan)，這表(biao)明它們利用陸(lu)地(di)來源(yuan)的(de)(de)(de)(de)有(you)機物(wu)(wu)進行生(sheng)(sheng)長。所(suo)(suo)使(shi)用的(de)(de)(de)(de)技術方(fang)法也(ye)是(shi)根據旨在(zai)評估和(he)(he)(he)改善歐(ou)洲海(hai)(hai)洋(yang)水域質量的(de)(de)(de)(de)歐(ou)洲指(zhi)令2008/56/EC，是(shi)監(jian)(jian)測沿(yan)海(hai)(hai)地(di)區(qu)(qu)的(de)(de)(de)(de)一(yi)(yi)種有(you)用和(he)(he)(he)快速的(de)(de)(de)(de)方(fang)法。海洋(yang)(yang)微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)具(ju)有(you)(you)高(gao)(gao)度的(de)動態性(xing)，對生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)態系統(tong)性(xing)質的(de)變化反(fan)應(ying)(ying)非常快(kuai)，從而導致(zhi)急性(xing)污染(ran)事件(jian)為了(le)(le)捕捉這(zhe)些(xie)反(fan)應(ying)(ying)并(bing)確定其原因，需要(yao)高(gao)(gao)頻準(zhun)確的(de)測量。大多數(shu)用(yong)(yong)于(yu)監測海洋(yang)(yang)微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)的(de)方(fang)(fang)法(fa)都存在(zai)重復性(xing)低、響(xiang)應(ying)(ying)時間(jian)長和(he)(he)(he)對勞動力要(yao)求(qiu)高(gao)(gao)的(de)問題。流(liu)式細(xi)胞(bao)(bao)術(shu)(shu)提供了(le)(le)一(yi)個解決這(zhe)些(xie)限制的(de)方(fang)(fang)法(fa)，允許快(kuai)速(su)、準(zhun)確和(he)(he)(he)可(ke)復制的(de)海洋(yang)(yang)微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)計數(shu)，并(bing)在(zai)海洋(yang)(yang)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)態學研究中得到了(le)(le)廣(guang)泛的(de)應(ying)(ying)用(yong)(yong)。流(liu)式細(xi)胞(bao)(bao)術(shu)(shu)是(shi)一(yi)種(zhong)利(li)用(yong)(yong)散射(she)和(he)(he)(he)熒(ying)(ying)(ying)光來鑒別和(he)(he)(he)計數(shu)細(xi)胞(bao)(bao)類型的(de)非軸(zhou)測、基于(yu)單細(xi)胞(bao)(bao)的(de)方(fang)(fang)法(fa)。由(you)于(yu)光合色素的(de)自(zi)(zi)熒(ying)(ying)(ying)光性(xing)，光合微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)可(ke)以直接(jie)分(fen)析(xi)(xi)，而非自(zi)(zi)熒(ying)(ying)(ying)光微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)（如(ru)異養(yang)細(xi)菌）則需要(yao)在(zai)分(fen)析(xi)(xi)前進行染(ran)色。染(ran)色步驟需要(yao)樣品處理和(he)(he)(he)孵育(yu)時間(jian)，這(zhe)是(shi)正確評估細(xi)胞(bao)(bao)濃度所必需的(de)。在(zai)環境科學中，自(zi)(zi)動流(liu)式細(xi)胞(bao)(bao)術(shu)(shu)已用(yong)(yong)于(yu)自(zi)(zi)發熒(ying)(ying)(ying)光微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)和(he)(he)(he)染(ran)色后(hou)的(de)異養(yang)細(xi)菌。我們將這(zhe)兩種(zhong)方(fang)(fang)法(fa)結合起來，分(fen)別使用(yong)(yong)了(le)(le)用(yong)(yong)于(yu)在(zai)線分(fen)析(xi)(xi)光營養(yang)微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)的(de)Cytosense（CytoBuoy BV）和(he)(he)(he)連接(jie)到海洋(yang)(yang)航行船(chuan)的(de)泵(beng)的(de)OnCyt自(zi)(zi)動流(liu)式細(xi)胞(bao)(bao)儀（OnCyt Microbiology AG）。證明(ming)了(le)(le)高(gao)(gao)空間(jian)分(fen)辨率監測表面微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)分(fen)布(bu)是(shi)可(ke)行的(de)，并(bing)提供了(le)(le)有(you)(you)用(yong)(yong)的(de)第一(yi)手信息，可(ke)用(yong)(yong)于(yu)快(kuai)速(su)和(he)(he)(he)實時地指示水質。2017年6月19日在RV Vettoria上采樣。地表水由船泵通過在線熱鹽計 (SBE45 MicroThermalSalinograph，Seabird Electronics)，測量溫度和鹽度，并通過在線熒光計測量總熒光(CycloPS7，Turner Design 連接databank）。然后，水流過采樣裝置（Cytobuy BV)，并依次通過Cytosense流式細胞儀（Cytobuy BV）和OnCyt在線流式細胞儀。
Cytosense每2分鐘分析一次樣品，而OnCyt每13分鐘（取決于染色時間）分析一次樣品，對應每1km 采樣一次，取決于船速。常規流式細胞儀分析的離散樣本每10分鐘在表面采集一次，以驗證onCyt計數。在，將這些樣品固定、冷凍并稍后在實驗室用SYBRGreen染色后進行分析。從CytoSense中，獲得了Synechochoccus sp（藍藻）、微微真核生物（1-3μm大小的混合種群）和納米真核生物的計數（2-10μm大小），同時onCyt提供非熒光，主要是異養細菌的濃度。盡(jin)管(guan)對于自養微微浮游生物(wu)(wu)（藍(lan)藻和(he)(he)(he)微微真核(he)(he)生物(wu)(wu)），onCyt系(xi)(xi)統(tong)與傳統(tong)流式細(xi)(xi)胞(bao)術的比(bi)較已(yi)(yi)有(you)報道，而且對于異養微生物(wu)(wu)，onCyt系(xi)(xi)統(tong)已(yi)(yi)用(yong)(yong)(yong)于淡水系(xi)(xi)統(tong)，但其在海水中(zhong)的應用(yong)(yong)(yong)仍需測試。因此，我(wo)們調整了染色方案，以適應onCyt在培養溫(wen)度和(he)(he)(he)時間方面的需要。為了保證測量的準確性，在含50 mM EDTA染色之前，樣(yang)品中(zhong)加入多聚甲醛和(he)(he)(he)戊二(er)醛的混合物(wu)(wu)（1%和(he)(he)(he)0.05%最終濃度）。使用(yong)(yong)(yong)CytSense和(he)(he)(he)onCyt獲(huo)得的細(xi)(xi)胞(bao)計數與通過常規流式細(xi)(xi)胞(bao)術獲(huo)得的計數顯(xian)著正相關(guan)，如圖所示，對于細(xi)(xi)菌，計數和(he)(he)(he)亞群（高(gao)核(he)(he)酸(suan)(suan)，HNA和(he)(he)(he)低核(he)(he)酸(suan)(suan)，LNA，圖1c和(he)(he)(he)d）都適用(yong)(yong)(yong)。
圖1 通過CytoSense、onCyt和常規流式細胞術（Verse）獲得的數據驗證。
a）CytoSenseVs Verse藍藻聚球藻計(ji)數(shu)的(de)相關性(xing)b）onCyt Vs Verse總異養(yang)(yang)細(xi)(xi)(xi)菌(jun)計(ji)數(shu)的(de)相關性(xing)c）通過onCyt獲得的(de)異養(yang)(yang)細(xi)(xi)(xi)菌(jun)的(de)流(liu)(liu)式(shi)圖d）通過Verse獲得的(de)異養(yang)(yang)細(xi)(xi)(xi)菌(jun)生的(de)流(liu)(liu)式(shi)圖
上(shang)船(chuan)后，兩臺(tai)流(liu)式細胞儀(yi)在(zai)熱鹽分析儀(yi)之(zhi)后連(lian)接到船(chuan)上(shang)的采(cai)樣線(xian)(xian)上(shang)。然后海水被分成兩條(tiao)線(xian)(xian)，一條(tiao)通向(xiang)CytSense，另一條(tiao)通向(xiang)onCyt。兩臺(tai)儀(yi)器同時(shi)采(cai)集了樣本(ben)。
圖2 顯示了船的軌(gui)跡以及(ji)巡航期(qi)間(jian)收集的溫度、鹽度和(he)熒光值。
兩個低鹽(yan)度(du)區(qu)域很(hen)明顯，一個靠近港口（Torre Annunziata），另一個位(wei)于受(shou)薩(sa)諾河（Sarno）影響的區(qu)域。第(di)一個位(wei)于離海岸一英里的城(cheng)(cheng)市垃圾收(shou)集站附(fu)近。第(di)二條河流與薩(sa)諾河相對應，薩(sa)諾河流經(jing)幾(ji)個農村和城(cheng)(cheng)市地(di)區(qu)，然(ran)后排入(ru)那不勒(le)斯灣。a）溫度(du)，b）葉綠素熒光，c）航跡，d）鹽(yan)度(du)。箭頭表(biao)示鹽(yan)度(du)較低的地(di)點，Torre Annunziata（上圖(tu)）和Sarno（下(xia)圖(tu)）
細(xi)菌總濃度(du)顯示(shi)出這兩個(ge)區域對應的(de)峰值，第(di)一(yi)個(ge)區域（Torre Annunciata）的(de)最(zui)高濃度(du)為(wei)(wei)1.5 x 106cell/ml，第(di)二個(ge)區域（Sarno）的(de)濃度(du)為(wei)(wei)1.4 x 106cell/ml（圖(tu)3）。盡管HNA在(zai)Torre Annunziata占(zhan)主導(dao)地位(wei)，但(dan)HNA和(he)LNA均存(cun)在(zai)于Sarno現(xian)場（未顯示(shi)），表(biao)明采樣(yang)軌跡沿線(xian)的(de)群(qun)落組成發生(sheng)了(le)變化。事實上，HNA和(he)LNA現(xian)在(zai)被(bei)識別為(wei)(wei)不同的(de)細(xi)菌集群(qun)，最(zui)終代表(biao)了(le)相同的(de)較大分支，但(dan)屬(shu)于不同的(de)分類(lei)單元，而(er)不像以前(qian)認為(wei)(wei)的(de)那(nei)樣(yang)，是更多（HNA）或更少(shao)（LNA）活性細(xi)菌。
圖3 樣本軌跡（左側(ce)）和中異養細菌總濃度（右側(ce)）cell/ ml
在(zai)(zai)Sarno現場采(cai)集(ji)的(de)樣(yang)本顯示存在(zai)(zai)大腸桿(gan)菌(jun)，這(zhe)是(shi)近期(qi)糞便污染(ran)的(de)指標，但(dan)在(zai)(zai)Torre Annunziata現場（Milva Pepi，pers.Comm.）沒有，這(zhe)表明(ming)在(zai)(zai)僅根據(ju)細菌(jun)總(zong)濃度正確評估人類(lei)健康(kang)風(feng)險之前(qian)，進一步(bu)進行細菌(jun)分(fen)析的(de)重(zhong)要性。有毒藻(zao)類(lei)也是(shi)如此，其(qi)中單(dan)獨的(de)分(fen)類(lei)鑒定(ding)并不總(zong)是(shi)與必(bi)須(xu)使(shi)用其(qi)他適當的(de)檢(jian)測方法(fa)證明(ming)的(de)毒素(su)的(de)存在(zai)(zai)相對應。
自養(yang)微(wei)(wei)生物(wu)組分(fen)也顯示出兩個區(qu)域之間(jian)的(de)(de)明顯分(fen)離，藍(lan)(lan)細(xi)菌聚球藻（Synechococcus）在南部(bu)地區(qu)占優(you)勢(shi)，而微(wei)(wei)微(wei)(wei)真核(he)生物(wu)和隱藻在北(bei)部(bu)地區(qu)占優(you)勢(shi)（圖(tu)4）。這也證實了先前的(de)(de)觀(guan)察結(jie)果，表明原(yuan)核(he)生物(wu)（藍(lan)(lan)藻）與大型真核(he)生物(wu)（微(wei)(wei)微(wei)(wei)真核(he)生物(wu)和隱藻）對不同的(de)(de)環境線(xian)索做出反應，后者通常負責總葉綠素的(de)(de)峰值（如(ru)熒光模式所示，圖(tu)1b）。
圖4 樣本軌跡（左側）和a）聚球(qiu)藻(zao)b）微(wei)微(wei)真(zhen)核生物c）隱(yin)藻(zao)濃度cell/ml自(zi)動高(gao)頻流式細(xi)(xi)胞儀被證明是一種檢測海(hai)洋(yang)微生物的(de)成本效(xiao)益高(gao)、速度快的(de)方(fang)法，允許實時測量細(xi)(xi)胞濃度與環(huan)(huan)境(jing)因(yin)素相(xiang)關性，以(yi)便(bian)解釋和潛在地(di)用(yong)作水(shui)(shui)質(zhi)標(biao)志，并為進一步干預鋪平道路。反(fan)過(guo)來，微生物群落，特(te)別是異養細(xi)(xi)菌(jun)，似(si)乎(hu)是環(huan)(huan)境(jing)條件變化的(de)有用(yong)標(biao)志，需要考慮(lv)并納入水(shui)(shui)質(zhi)評估，如歐洲指令2008/56/EC所要求(qiu)的(de)，其(qi)目標(biao)是在2020年內達到所有歐洲水(shui)(shui)域的(de)良(liang)好環(huan)(huan)境(jing)狀態（GES）。
由于細菌(jun)細胞總數可(ke)能(neng)不會進一(yi)(yi)步反映致(zhi)病性或毒性對人類健康的(de)風險，因此必須謹慎(shen)行事。然而，流式細胞術可(ke)能(neng)是首(shou)次篩選的(de)一(yi)(yi)種有價值的(de)方法，實(shi)時預警潛在(zai)的(de)關鍵位點，以(yi)便(bian)通過其他方法進一(yi)(yi)步監(jian)測和控制(zhi)。
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