雜草的競爭造成的產量損失限制了水稻（Oryza sativa L.）的生產。施用化學除草劑是目前水稻生產中控制雜草的有效方法，特別是在現代簡化栽培系統的背景下。然而，長期大量使用除草劑，如5-烯醇丙酮酰亞胺-3-磷酸合成酶（EPSPS）、乙酰乳酸合成酶（ALS）和乙酰-CoA羧化酶（ACCase）的抑制劑，導致了抗除草劑雜草品種的出現，以及土壤中除草劑的高度殘留，這限制了作物輪作。因此，水稻生產上迫切需要可替代的除草劑和培育相應抗除草劑的抗性水稻品種。
2009年以來，HPPD抑制劑類除草劑市場幾乎逐年增長，成為除草劑市場增長很快的產品類型之一。HPPD抑制劑類除草劑全稱是對羥基苯基丙酮酸雙氧化酶（HPPD）抑制劑，它們通過抑制HPPD的活性，使對羥基苯基丙酮酸轉化為尿黑酸的過程受阻，導致生育酚及質體醌無法正常合成，進而影響靶標體內類胡蘿卜素的生物合成，促使植物分生、新生組織產生白化癥狀，最終導致雜草植株死亡。大多HPPD類型的除草劑結構上并不完全相關，但是作用效果相同。與其他除草劑相比，HPPD抑制劑的優勢在于其廣譜性、高效力、低毒性、高的作物安全性和良好的環境兼容性。因此，HPPD抑制劑是公認的具有優異潛力的水稻除草劑，硝磺草酮（MST）是HPPD抑制劑類除草劑中很重要的產品之一，常用于玉米田防治闊葉雜草和部分禾本科雜草。
近日，江蘇里下河地區農業科學研究所的研究團隊在《Plant Communications》在線發表了題為“CRISPR/Cas9-mediated editing of OsHPPD 3’-UTR confers enhanced resistance to HPPD-inhibiting herbicide in rice”的研究論文，介紹了研究團隊利用(yong)CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a基(ji)因(yin)(yin)編輯(ji)系統對水稻HPPD抑(yi)制(zhi)劑抗性基(ji)因(yin)(yin)OsHPPD的3’-UTR進行基(ji)因(yin)(yin)編輯(ji)，創造了水稻HPPD抑(yi)制(zhi)性除草劑抗性新種質材料，且沒有產生其他農藝性狀的不利影響。
基因編輯已成為快速改進作物的有力工具，水稻的多個農藝性狀基因已被成功編輯。基因編輯應用多是針對基因編碼序列（CDS）或特定基因的啟動子區域。然而，一些基因由于其特殊的功能，其CDS和啟動子區域不能被編輯。相比之下，3′非翻譯區（3′-UTR）是一個非編碼的mRNA片段，參與基于mRNA的調控過程，包括mRNA的定位、穩定和翻譯。此外，3′-UTRs還能調控許多蛋白質的特性，包括蛋白質復合物的形成、轉錄后修飾和蛋白質的構象變化。因此，3′-UTRs對高等生物(wu)的(de)多個(ge)生物(wu)學過程至關(guan)重要，是潛(qian)在的(de)基(ji)因(yin)編輯區域(yu)，可應用來創制新(xin)的(de)水稻種質(zhi)。
為了驗證這一假設，研究團隊嘗試用CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a系統編輯OsHPPD基因的3'-UTR，創造HPPD抑制劑類除草劑抗性的水稻材料。在水稻中，OsHPPD（LOC_Os02g07160）包含一個265bp片段長度的3′-UTR（圖1A）。為了評估OsHPPD基因3′-UTR中的哪些突變可能引起MST抗性，研究團隊使用在線工具（//crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR/CRISPR）在265bp的3′-UTR內選擇了10個目標位點（TS1-TS10）進行編輯（圖1B）。研究團隊將得到的10個單向導RNAs（sgRNAs）分別克隆到CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a載體，然后將這些載體通過農桿菌導入粳稻栽培品種Yanggeng3012（YG3012）中，該品種適合種植在中國江蘇省。最終，研究團隊獲得了135個靶位點突變的T2個體（來源于97個T0轉化體）（圖1C）。
圖1A-C OsHPPD基因示意圖及其3′-UTR的編輯位點和編輯事件
研究團隊使用硝磺草酮（MST）來測試T2個體的除草劑抗性。為了確定田間條件下合適的MST劑量，研究團隊在施用11種不同劑量的MST后，對10個秈稻品種和10個粳稻品種的存活率進行了測量。結果顯示，秈稻品種對MST的敏感性高于粳稻品種。在施用45 g ai ha-1 濃度的MST后，秈稻品種和粳稻品種的平均存活率分別為50.5%和84.25%。提高MST的濃度會導致植株成活率顯著下降。在施用120 g ai ha-1濃度MST后，粳稻品種和秈稻品種的平均存活率分別為2.95%和3.5%（圖1D）。因此，研究團隊最終選用120 g ai ha-1濃度的MST來評估所有135個T2突變體品系在田間條件下的除草劑抗性。經過14天的處理，只有兩個品系（TS8-2#和TS8-8#）能夠存活，而其他133個T2品系和野生型材料均已死亡（圖1E）。
圖(tu)1D&E施用階(jie)梯濃度MST后不同粳(jing)稻和秈稻品種的(de)存活率
通過一代測序，研究團隊驗證了TS8-2#和TS8-8#中sgRNA靶位點確實發生了編輯突變。值得注意的是，這兩個抗性品系是在同一個位點產生了突變。其中，TS8-2#是純合子，在2304位置有一個1bp的缺失，而TS8-8#是雜合子（WT/+1），在第2304位有1bp的插入（圖1F）。研究團隊通過PCR測序最終選擇了兩個無轉基因的純合子編輯系（TS8-2#-10和82TS8-8#-6）用于后續分析（圖1G、H）。
圖1F-H TS8-2#和TS8-8#中sgRNA靶位點編輯突變情況
為了進一步研究TS8-2#-10和TS8-8#-6的抗性水平，研究團隊在溫室條件下測試TS8-2#-10、TS8-8#-6以及野生型對不同MST劑量的反應。MST劑量梯度為0、0.125×、0.25×、0.5×、1×、2×、4×和8×，其中1×代表120 g ai ha-1。在施用480g ai ha-1濃度的MST后，野生型植株全部死亡，而TS8-2#-10和TS8-8#-6植株則存活下來，并達到未處理對照植株鮮重的44.2%和29.8%（圖1I）。據此，研究團隊繪制了植株鮮重的MST劑量反應曲線，作為計算MST GR50值（使生長減少50%的除草劑劑量）的函數曲線（圖1J）。野生型的GR50值為71.14±6.12 g ai ha-1，比TS8-2#-10（338.63±26.33 g ai ha-1）和TS8-8#-6（263.87±19.34 g ai ha-1)的GR50值低得多。基于抗性指數（RI）的計算值，基因編輯品系TS8-2#-10和TS8-8#-6對HPPD抑制性除草劑表現出的抗性水平分別是野生型抗性的4.8倍和3.7倍。
圖1I&J TS8-2#-10、TS8-8#-6以及野生型對不同MST劑量的反應
為了(le)確(que)定兩個(ge)抗MST除草(cao)劑(ji)基(ji)因編輯品(pin)系是否對(dui)其(qi)他(ta)農(nong)藝性(xing)狀產(chan)生不利(li)影響，研究團隊對(dui)未施用(yong)MST除草(cao)劑(ji)的田間條件下的植株農(nong)藝性(xing)狀進行了(le)測定。
結果顯示，MST抗性株系TS8-2#-10和TS8-8#-6與野生型株系之間沒有明顯的表型差異（圖1K）。這表明編輯水稻OsHPPD基因3′-UTR特定位點可以增加MST抗性，但不影響其他農藝性狀。
圖1K TS8-2#-10、TS8-8#-6與野生型的農藝性狀表現
綜上所示，本研究通過對水稻OsHPPD基因3'-UTR進行位點基因編輯，創造了水稻HPPD抑制性除草劑抗性新種質材料，且沒有產生其他農藝性狀的不利影響。此外，本研究強調了CRISPR/Cas9介導的優良基因3'-UTR基因編輯，可以促進植物重要農藝性狀的改良。
—— 參考文獻 ——
Wu Y, Xiao N, Cai Y, et al. CRISPR/Cas9-mediated editing of OsHPPD 3'-UTR confers enhanced resistance to HPPD-inhibiting herbicide in rice[J]. Plant Communications, 2023, 100605.
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