玉(yu)米是世界(jie)上最重要的(de)(de)(de)作物(wu)之一，是重要的(de)(de)(de)糧、經、飼兼用作物(wu)。玉(yu)米小斑病(bing)（SLB）、大斑病(bing)（NLB）和莖腐病(bing)（FSR）等病(bing)害給玉(yu)米產量造(zao)成(cheng)了巨大的(de)(de)(de)損失。鑒(jian)定抗(kang)性基因和培(pei)育具有多種病(bing)害抗(kang)性（MDR）的(de)(de)(de)遺傳材料是控制病(bing)害和減少(shao)產量損失的(de)(de)(de)最有效方法。然而(er)，目前已發現(xian)的(de)(de)(de)具有MDR的(de)(de)(de)抗(kang)性基因非常有限(xian)。已有研究證(zheng)明使用CRISPR/Cas9工具編輯感病（S）基因（例如Mlo和MDR6）產生的基因組編輯材料是賦予重要經濟作物抗病性的有效方法。對于植物(wu)抗(kang)性(xing)育(yu)種，挖掘和克隆新的感病（S）基因迫在(zai)眉睫。
在多種植物(wu)中，煙(yan)堿(jian)酸N-甲(jia)基轉移酶1（NANMT1）是(shi)煙(yan)堿(jian)酸轉化為葫蘆巴堿(jian)（也被稱為N-甲(jia)基煙(yan)堿(jian)酸）的(de)關鍵酶。山東大學的(de)研究團隊前期的(de)研究發現(xian)，當與NLR (Nucleotide-binding，leucine rich repeat) 蛋白Rp1-D21在煙草系(xi)(xi)統中(zhong)瞬時共表(biao)達(da)(da)時，玉(yu)米ZmNANMT能夠抑(yi)制NLR介導的(de)(de)超(chao)敏反應（HR）。攜(xie)帶雜合(he)體Rp1-D21的(de)(de)玉(yu)米品系(xi)(xi)表(biao)現出自激活免疫的(de)(de)表(biao)型(xing)，包括生長遲緩和無病原菌侵染的(de)(de)HR病點(dian)。為了進一(yi)步驗證(zheng)ZmNANMT是(shi)否(fou)能抑(yi)制玉(yu)米中(zhong)Rp1-D21介導的(de)(de)HR，研究團(tuan)隊前期通(tong)過(guo)pXG071載體構建了ZmNANMT過(guo)表(biao)達(da)(da)玉(yu)米株(zhu)系(xi)(xi)。由于DsRed2熒光標記在糊粉(fen)層(ceng)中(zhong)特(te)異表(biao)達(da)(da)，通(tong)過(guo)眼睛觀察即可區分(fen)陽性和陰性的(de)(de)轉基因(yin)種子。
近日，山東大學的該研究團隊在以前的研究基礎之上在《Plant Biotechnology Journal》在線發表了題為“Genome editing of the susceptibility gene ZmNANMT confers multiple disease resistance without agronomic penalty in maize”的研究論文，介紹了研究團隊發現玉米中一個新的感病基因ZmNANMT，通過基因編輯ZmNANMT提高了玉米對多種病害的廣譜抗性，并且不影響玉米其他重要農藝性狀。
研(yan)究團隊(dui)從15個(ge)獨(du)立的(de)轉基因(yin)株(zhu)系中，獲(huo)(huo)得(de)了3個(ge)純合基因(yin)型的(de)ZmNANMT過(guo)表(biao)達的(de)T3株(zhu)系（OE-3、OE-4和(he)OE-11），以(yi)及與(yu)其(qi)對應的(de)陰性同胞株(zhu)系（Neg-3、Neg-4和(he)Neg-11），其(qi)蛋白質印(yin)跡（western blot）結果如圖1a所示。研(yan)究團隊(dui)將OE-3和(he)Neg-3雜交獲(huo)(huo)得(de)含有雜合Rp1-D21的(de)F1株(zhu)系，F1植株(zhu)顯示出Rp1-D21蛋白1:1的(de)分離比(bi)，包括OE-3×Rp1-D21、OE-3×no Rp1-D21、Neg-3×Rp1-D21和(he)Neg-3×no Rp1-D21單株(zhu)。在田間V6生長階(jie)段，Neg-3×Rp1-D21植(zhi)(zhi)(zhi)株(zhu)在(zai)第6和第7片(pian)葉顯(xian)現(xian)出非常(chang)明顯(xian)的(de)HR病斑（圖2a&b）。而與陰(yin)性對照(zhao)相比，OE-3×Rp1-D21植(zhi)(zhi)(zhi)株(zhu)的(de)HR病斑則表(biao)現(xian)較弱（圖2a&b）。在(zai)抽穗期(qi)，OE-3×Rp1-D21的(de)植(zhi)(zhi)(zhi)株(zhu)明顯(xian)高于(yu)其陰(yin)性對照(zhao)Neg-3×Rp1-D21植(zhi)(zhi)(zhi)株(zhu)（圖2c）。這些結果表(biao)明，ZmNANMT在玉米中NLR蛋白Rp1-D21介導的HR中起負調控作用，且過量表達ZmNANMT可以部分克服Rp1-D21介導的自激活免疫表型。
圖1 過表達株系的蛋白檢測和三個CRISPR/Cas9株系ZmNANMT的序列
為了確定ZmNANMT基因在玉米抗病中的作用，研究團隊鑒定了ZmNANMT過表達株系的玉米主要病害表型，這些病害包括小斑病（SLB）、大斑病（NLB）和莖腐病（FSR）。結果顯示，在田間條件下OE-3、OE-4和OE-11植株對SLB、NLB和FSR的感病性高于其對應的野生型同胞植株（圖2d-f）。這表明ZmNANMT是一個玉米多種病害的的感病基因。
圖2 ZmNANMT在玉米防御反應中起著負面作用，對其進行基因組編輯可賦予玉米多種病害抗性且不產生其他農藝性狀缺陷
為了探明對ZmNANMT進行基因組編輯能否增強MDR，研究團隊設計了兩個單鏈向導RNA（sgRNA1和sgRNA2），利用CRISPR/Cas9系統來靶標ZmNANMT（圖1b）。從12個獨立的轉基因事件中篩選到3個純合子基因編輯株系：CR-6（sgRNA1和sgRNA2都有1bp的插入）、CR-8（sgRNA1有1 bp插入）和CR-10（sgRNA1附近有31bp的缺失）（圖1b）。所有這三個基因編輯株系都是不含Cas9的，且有預測的開放讀碼框偏移（圖1c）。通過調查在不同條件下T2或T3植株對不同病害的反應，研究團隊發現CR株系對FSR、SLB和(he)NLB的抗(kang)性分別明顯高于與其對應的野生(sheng)型同胞株系（圖(tu)2g-i）。
圖3 ZmNANMT的過(guo)表達植株的農藝(yi)性狀
為了(le)確定ZmNANMT是否對玉米的主要農藝性狀(zhuang)有(you)任何(he)負面影響(xiang)，研究團隊(dui)在田間種植了(le)OE株(zhu)系和CR株(zhu)系2年。表型鑒定結果顯示(shi)，OE株系和基因編輯株系在果穗大小和其他農藝性狀方面與對應的野生型同胞對照沒有顯著差異(圖2j&k、圖3和圖4）。
圖4 ZmNANMT基因CRISPR/Cas9編輯株系的農藝性狀
綜上所述(shu)，研究團隊(dui)發現了ZmNANMT是(shi)一個新型植(zhi)物感病(bing)基因，通過基因編輯(ji)能夠增強玉米對多種病(bing)害的(de)(de)(de)(de)廣譜(pu)抗性并且不(bu)(bu)影響(xiang)玉米的(de)(de)(de)(de)產量。NANMT可(ke)(ke)以(yi)將煙酸轉化為(wei)葫蘆巴堿(jian)，其功能在不(bu)(bu)同(tong)植(zhi)物物種中是(shi)保守的(de)(de)(de)(de)，CR植(zhi)株的(de)(de)(de)(de)MDR的(de)(de)(de)(de)增加(jia)可(ke)(ke)能是(shi)由NA的(de)(de)(de)(de)積累引起(qi)的(de)(de)(de)(de)，NA可(ke)(ke)以(yi)增加(jia)植(zhi)物的(de)(de)(de)(de)抗病(bing)性。本研究為培育優良多抗品種提供了新的基因資源。
—— 參考文(wen)獻 ——
Li Y J, Gu J M, Ma S, et al. Genome editing of the susceptibility gene ZmNANMT confers multiple disease resistance without agronomic penalty in maize[J]. Plant Biotechnology Journal, 2023.
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