水稻是(shi)世界(jie)上(shang)最重(zhong)要的(de)糧(liang)食(shi)作物(wu)之一(yi)，是(shi)一(yi)半人口的(de)主食(shi)，生(sheng)產上(shang)常受到稻瘟病(bing)(bing)、紋枯病(bing)(bing)等多(duo)種(zhong)病(bing)(bing)害威脅(xie)。由稻瘟病(bing)(bing)菌引起(qi)的(de)稻瘟病(bing)(bing)每年造成的(de)產量損失可以養活6000多(duo)萬人。水稻適(shi)用于基(ji)因編輯技術，培育抗病(bing)(bing)特(te)別是(shi)廣譜(pu)抗病(bing)(bing)水稻品種(zhong)，是(shi)實(shi)現(xian)作物(wu)病(bing)(bing)害綠色(se)防控的(de)有效(xiao)措施。
2023年6月14日，Nature發表了華中農業大學李國田教授團隊牽頭完成的題為“Genome editing of a rice CDP-DAG synthase confers multipathogen resistance”的研究論文，該團隊通過篩選病變模擬突變體(LMM)克隆到了“RBL1”廣譜抗病基因，此突變體具有廣譜抗病性但會造成嚴重減產。通過靶向基因編輯RBL1，獲得了rbl1Δ12突變體，并經多年田間試驗評估，該突變體具有廣譜抗病性，但不會降低產量。
研(yan)究團隊首先從KitaaKe水稻(dao)1500多(duo)份已全(quan)基(ji)因組(zu)測(ce)序的(de)快中(zhong)子(zi)誘(you)變系中(zhong)，篩選(xuan)到了稻(dao)瘟(wen)菌抗性增強的(de)名為rbl1的LMM，但該突(tu)變體具有(you)低育性（圖1a-f）。接種稻瘟菌后(hou)，與KitaaKe相比，真(zhen)菌菌絲在(zai)rbl1中的傳播受到(dao)限制，rbl1表現(xian)出(chu)ROS的顯(xian)著上調、水楊酸的積累和(he)植物防御相關基因的激(ji)活（補充(chong)圖2）。對rbl1植株的(de)分離(li)群體(ti)進行遺傳(chuan)分析和測序，在RBL1基因中發現了一個29個堿(jian)基對(dui)(bp)的(de)缺失(LOC_Os01g55360)（圖1j）。蛋(dan)白(bai)序列分(fen)析和遺傳互(hu)補實驗(yan)證實RBL1是(shi)致病基因（圖1k-p）。此外通過組織定(ding)量(liang)實驗和GUS染(ran)色分析可知，RBL1在所(suo)有組(zu)織中轉錄(lu)，在葉片中含量最高，且其表達(da)受到稻瘟菌(jun)感染(ran)的(de)誘導。
補充圖2 rbl1株系的植物防御相關基因表達、產量及遺傳互補實驗
圖1 從具有增強免(mian)疫的LMM rbl1中克隆(long)到RBL1基因
為鑒定RBL1的生物學功能，通過酵母實驗和脂質組學分析，RBL1作為一種完整的膜(mo)蛋白，具有CDP-DAG合成(cheng)酶(mei)的功(gong)能（圖2 a-c）。利(li)用脂質組學技術(shu)在rbl1和KitaaKe水稻中測定CDS1相關的植物甘油(you)酯代(dai)謝途徑上(shang)的脂類，相對(dui)KitaaKe，rbl1水(shui)稻中磷(lin)脂(zhi)酸(suan)（PA）和DAG的(de)(de)含量升(sheng)高，磷(lin)脂(zhi)酰(xian)肌醇（PI）和磷(lin)脂(zhi)酰(xian)甘油（PG）的(de)(de)水(shui)平顯著降(jiang)低（圖2d）。且磷(lin)脂(zhi)酰(xian)肌醇的(de)(de)減少(shao)是磷(lin)脂(zhi)改變(bian)最顯著的(de)(de)結果(guo)（圖2e）。補充圖(tu)1 與胞苷二(er)(er)磷酸(suan)-甘(gan)油二(er)(er)酯(zhi)合成酶(mei)1（CDS1）相關(guan)的植物甘(gan)油脂代謝(xie)途(tu)徑為了測試外源性補充磷脂是否可以挽救LMM表型，我們進行了化學互補試驗，觀察到外源添加磷脂酰肌醇的培養基，推遲了rbl1的病斑形成，而磷脂酸加速了的病斑形成(補充圖5a - d)。將呼吸爆發氧化酶同源蛋白( RBOH ) 抑制劑二亞苯基碘化銨應用于rbl1，可以緩解LMM表型(補充圖5e)。補充圖5 外源添加磷脂酰肌醇延緩了rbl1的病斑形成為了測試增加磷脂酰肌醇的含量是否可以挽救LMM表型，研究團隊在rbl1中過表達水稻PIS1（OsPIS1）。與rbl1相比，OsPIS1：：rbl1系中的病斑比例減少（圖）。2f-i），病程相關（PR）基因的表達量和稻瘟菌抗性降低，但高于KitaaKe（圖2f-j）。同時OsPIS1::rbl1植株的磷脂酰肌醇含量恢復到KitaaKe的80%，PtdInsP和PtdInsP2的含量完全恢復（圖2k）。同樣在rbl1中過表達了磷脂酸磷酸水解酶編碼基因OsPAH2(圖2i)。OsPAH2::rbl1系中磷脂酸含量恢復，PR基因的表達水平僅略有下降，病斑比例和稻瘟菌抗性沒有改變(圖2m - o)。這表明rbl1中磷脂酸水平的升高僅以有限的方式有助于增強免疫力。因此該團隊隨后的研究重點放在磷脂酰肌醇衍生物上。圖2 RBL1作為CDP - DAG合成酶發揮功能，rbl1中磷脂酰肌醇水平升高能更好地平衡抗性和生物量。脂質印跡結果顯示在rbl1植物中膜PtdIns(4,5)P2減少（圖3a，b），為進一步分析真菌侵染過程中PtdIns(4,5)P2在原位的時空變化，研究團隊構建了表達PtdIns(4,5)P2生物傳感器的穩定轉基因水稻品系。在Kitaake中沿質膜均勻分布，但在rbl1中，PtdIns(4,5)P2在質膜上的信號微弱，并存在于未知囊泡中（圖3c），蛋白印跡Western blotting結果和熒光信號顯著降低(圖3d,e)。在稻瘟菌侵染后，PtdIns(4,5)P2迅速響應并聚集在侵入型菌絲尖端并侵襲外菌絲膜(EIHM)上（圖3g,h），富集在BIC感染特異性結構中（圖3i），但在rbl1中的細胞質未觀察到，BIC形成率僅7.1%，遠低于Kitaake的93.3%。綜合來看PtdIns（4,5）P2在(zai)真菌(jun)和水稻的(de)相互作用(yong)中發揮重要(yao)作用(yong)。圖3 rbl1植株中富集在侵染特異性結構中Ptd Ins ( 4,5)P2減少rbl1株系具有廣譜抗病(bing)性(xing)，但(dan)產(chan)量降低了約(yue)20倍(bei)，為了平衡抗病(bing)性(xing)和(he)產(chan)量，通過多重基(ji)因組(zu)編(bian)輯來構建和(he)篩選編(bian)輯株系，發現12個堿基(ji)缺(que)失的rbl1Δ12株系，表現出微小超敏反應樣病變，且產生正常的種子（圖4c，d），對10個稻瘟菌、5個Xoo菌株和2個稻曲病菌的菌株具有抗性（圖4 e-j）。相應地，與Kitaake相比，rbl1Δ12感染稻曲病菌的穎花中真菌毒素水平降低了66.2 % (圖4i )。通過無轉基因種子進行大田試驗，在不同地區低稻瘟菌的水稻產區種植，評估了多個關鍵農藝性狀，株高、單株分蘗數、結實率、千粒重和籽粒產量。除株高外，rbl1Δ12和Kitaake的所有測量性狀無明顯差異。綜上(shang)所述，Kitaake水稻的RBL1Δ12等位基因具(ju)有強大(da)的廣譜抗病性，而不會降低產量。圖4 rbl1Δ12具有廣譜抗病性，且在田間試驗中沒有觀察到產量損失rbl1Δ12中缺失的4個氨基酸具有保守性，ROS水平響應幾丁質與其他水稻類似，此外RBL1基因表達水平顯著降低（補充圖7b-d）。RBL1可回補rbl1Δ12，但rbl1Δ12不能回補rbl1（補充圖7j-i），與rbl1Δ12與Kitaake雜交的F2群體中稻瘟病菌抗性表現也證實了互補結果，說明RBL1位點以反向劑量調節來促進免疫力（補充(chong)圖7m-o）。此外研究團隊在兩個水稻品種“日本晴”和“中華11號”中生成了RBL1編輯的株系，稻瘟病菌抗性增強，生長正常，類似于rbl1Δ12(補充圖9)。補充圖(tu)7 rbl1Δ12株系及等位基因的鑒定本研究(jiu)結果(guo)揭示(shi)了(le)(le)磷脂代謝與抗病(bing)性的(de)(de)關系(xi)，獲得了(le)(le)具(ju)有(you)廣譜抗病(bing)性但不(bu)降(jiang)低(di)產量(liang)的(de)(de)株系(xi)，表明(ming)了(le)(le)微調參(can)與感(gan)染特異性結構形成的(de)(de)宿(su)主因子(zi)(zi)是平衡免疫力和(he)產量(liang)的(de)(de)策略(lve)，為作物(wu)抗病(bing)研究(jiu)方(fang)向做出重要參(can)考，應(ying)加(jia)大基因編(bian)輯技術對負調節因子(zi)(zi)的(de)(de)改造利用，且對不(bu)同的(de)(de)LMM基因和(he)作物(wu)具(ju)有(you)重要的(de)(de)參(can)考價值。華中農業(ye)大(da)學(xue)(xue)農業(ye)微(wei)生物(wu)資源發掘與(yu)利(li)(li)用(yong)(yong)全(quan)國(guo)重(zhong)點(dian)實驗(yan)室(shi)、湖北洪山(shan)實驗(yan)室(shi)李國(guo)田(tian)教(jiao)授(shou)和(he)加州大(da)學(xue)(xue)戴維斯分校/勞(lao)倫斯伯克利(li)(li)國(guo)家實驗(yan)室(shi)Pamela C. Ronald院士為該(gai)論文共(gong)(gong)同(tong)通(tong)訊(xun)作(zuo)(zuo)者。李國(guo)田(tian)教(jiao)授(shou)團隊博(bo)士研(yan)(yan)究生沙(sha)干、孫(sun)鵬為本(ben)論文共(gong)(gong)同(tong)第(di)一作(zuo)(zuo)者。西北農林科技大(da)學(xue)(xue)康振(zhen)生院士、法國(guo)波爾(er)多大(da)學(xue)(xue)Yohann Boutté教(jiao)授(shou)、作(zuo)(zuo)物(wu)遺傳(chuan)改良全(quan)國(guo)重(zhong)點(dian)實驗(yan)室(shi)郭(guo)亮教(jiao)授(shou)、李強教(jiao)授(shou)和(he)謝卡斌教(jiao)授(shou)、江西省農業(ye)科學(xue)(xue)院水稻研(yan)(yan)究所黃(huang)仁(ren)良副(fu)(fu)研(yan)(yan)究員、農業(ye)微(wei)生物(wu)資源發掘與(yu)利(li)(li)用(yong)(yong)全(quan)國(guo)重(zhong)點(dian)實驗(yan)室(shi)鄭露(lu)副(fu)(fu)教(jiao)授(shou)、深圳(zhen)華大(da)生命科學(xue)(xue)研(yan)(yan)究院丘璨(can)瑜副(fu)(fu)研(yan)(yan)究員、山(shan)東省農科院徐建第(di)研(yan)(yan)究員、澳(ao)大(da)利(li)(li)亞阿德萊德大(da)學(xue)(xue)Jenny Mortimer教(jiao)授(shou)等國(guo)內外科研(yan)(yan)機構研(yan)(yan)究人員參與(yu)了合作(zuo)(zuo)研(yan)(yan)究。
—— 參考文(wen)獻 ——
Sha, G., Sun, P., Kong, X., et al. . Nature, 2023, 618, 1017–1023.
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