由于(yu)全球氣候變化，大(da)多(duo)數農田(tian)栽培的(de)(de)(de)(de)(de)(de)作(zuo)物(wu)(wu)(wu)都有面(mian)臨嚴重脅(xie)(xie)(xie)迫(po)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)風險(xian)，使農業產量大(da)大(da)降低。通過(guo)成(cheng)(cheng)像(xiang)技(ji)術(shu)對(dui)(dui)作(zuo)物(wu)(wu)(wu)進行感(gan)知，可以(yi)(yi)在早(zao)期階段(duan)檢(jian)測(ce)到(dao)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)或(huo)非(fei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)脅(xie)(xie)(xie)迫(po)，從(cong)(cong)而避免損(sun)害(hai)和(he)(he)重大(da)減產。葉(xie)(xie)(xie)綠素(su)(su)a熒光(guang)成(cheng)(cheng)像(xiang)技(ji)術(shu)是用(yong)于(yu)植(zhi)物(wu)(wu)(wu)脅(xie)(xie)(xie)迫(po)檢(jian)測(ce)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)專業技(ji)術(shu)之一，具(ju)有廣(guang)泛的(de)(de)(de)(de)(de)(de)國際(ji)認可度(du)。它可以(yi)(yi)評估葉(xie)(xie)(xie)片的(de)(de)(de)(de)(de)(de)時空變化，在出現任何(he)肉眼(yan)可見(jian)癥狀之前就能(neng)對(dui)(dui)植(zhi)物(wu)(wu)(wu)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)理狀態進行癥狀前監測(ce)，從(cong)(cong)而實現高(gao)通量評估。在此，我們將舉例說明如何(he)利用(yong)葉(xie)(xie)(xie)綠素(su)(su)a熒光(guang)成(cheng)(cheng)像(xiang)分析(xi)來評估生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)和(he)(he)非(fei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)脅(xie)(xie)(xie)迫(po)。葉(xie)(xie)(xie)綠素(su)(su)a能(neng)夠(gou)在甜菜夜蛾攝食后(hou)15分鐘(zhong)、西紅柿植(zhi)株感(gan)染(ran)灰霉病(bing)后(hou)30分鐘(zhong)檢(jian)測(ce)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)脅(xie)(xie)(xie)迫(po)，或(huo)缺水脅(xie)(xie)(xie)迫(po)開(kai)始時檢(jian)測(ce)非(fei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)脅(xie)(xie)(xie)迫(po)，因此具(ju)有早(zao)期脅(xie)(xie)(xie)迫(po)檢(jian)測(ce)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)強大(da)潛力。葉(xie)(xie)(xie)綠素(su)(su)熒光(guang)(ChlF)分析(xi)是一種快速、非(fei)侵入性、易操作(zuo)、低成(cheng)(cheng)本和(he)(he)高(gao)靈敏(min)度(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)方法，可估測(ce)光(guang)合作(zuo)用(yong)性能(neng)并檢(jian)測(ce)各種脅(xie)(xie)(xie)迫(po)對(dui)(dui)植(zhi)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)影(ying)響(xiang)。在 ChlF 參數方面(mian)，開(kai)放的(de)(de)(de)(de)(de)(de)光(guang)系統Ⅱ(PSⅡ)反應中(zhong)心的(de)(de)(de)(de)(de)(de)比例(qP)可用(yong)于(yu)早(zao)期脅(xie)(xie)(xie)迫(po)檢(jian)測(ce)，因為(wei)最(zui)近的(de)(de)(de)(de)(de)(de)許多(duo)研究發現它是基于(yu)ChlF篩選環境脅(xie)(xie)(xie)迫(po)對(dui)(dui)植(zhi)物(wu)(wu)(wu)影(ying)響(xiang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)最(zui)準確和(he)(he)最(zui)合適(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)指標。
葉綠素是通過捕光天線吸收光能的主要分子。在光合作用的光反應中，捕光天線吸收的光能會被光化學反應轉化成電子進行傳遞，電子從光系統Ⅱ（PSⅡ）通過細胞色素b6f和質體藍蛋白（PC）轉移到光系統Ⅰ（PSⅠ），最終生成NADPH。除此之外，光系統Ⅱ（PSⅡ）作為一種大型色素-蛋白質復合物，還負責光合生物中水的光依賴性氧化，釋放分子氧并向類囊體膜內釋放質子（H+）。質子最終通過ATP合酶，合成ATP。NADPH和ATP均可用于光合作用的暗反應中CO2的固定和有機物的合成。
光合(he)作用(yong)電子傳遞(di)示意圖光反應的產物ATP和NADPH必須與碳水化合物和其他必需有機分子的合成相協調。否則，會產生活性氧（ROS）。在光能轉化為化學能的過程中，活性氧（ROS）在低水平上不斷形成，但它們被不同的抗氧化機制清除。這些 ROS 是單線態激發氧（1O2）、過氧化氫（H2O2）和超氧陰離子自由基（O2-）。過量的光能吸收肯定會使電子傳遞鏈容量過度飽和，導致ROS形成的可能性增加。生物和非生物脅迫，如干旱、鹽度、金屬毒性、冷卻、UV-B 輻射、昆蟲和病原體都導致ROS（H2O2， O2-, 1O2，OH）在植物體內產生的量增加，這是由于細胞穩態的破壞，可導致氧化應激。氧化應激是由酶促和非酶促抗氧化劑的ROS產生和清除之間的不平衡引起的。這種不平衡會導致細胞損傷，從而導致細胞死亡。因此，植物需要在細胞結構破壞之前對這種不平衡做出反應，以維持光合活性和全株存活。葉(xie)綠(lv)(lv)體(ti)是植物(wu)細胞中(zhong)ROS最重要的(de)(de)(de)創(chuang)造者，尤(you)其是光(guang)合作(zuo)用的(de)(de)(de)光(guang)反(fan)應(ying)。在大(da)多(duo)數環境脅(xie)迫(po)條件(jian)下，吸收(shou)的(de)(de)(de)光(guang)能(neng)超出其可控制的(de)(de)(de)量，因(yin)此(ci)會損害葉(xie)綠(lv)(lv)體(ti)。保護光(guang)合設備免(mian)(mian)受導致ROS產生的(de)(de)(de)過(guo)量光(guang)能(neng)的(de)(de)(de)過(guo)程是非光(guang)化學淬滅（NPQ）的(de)(de)(de)機(ji)(ji)制。植物(wu)已經(jing)發(fa)展(zhan)了幾種光(guang)保護機(ji)(ji)制，包括光(guang)通過(guo)葉(xie)片和(he)葉(xie)綠(lv)(lv)體(ti)運(yun)動逸出，NPQ機(ji)(ji)制通過(guo)吸收(shou)的(de)(de)(de)光(guang)能(neng)作(zuo)為(wei)熱能(neng)耗散，PSⅠ周(zhou)圍的(de)(de)(de)循環電(dian)子傳輸，光(guang)呼吸途徑(jing)和(he)ROS清除系統(tong)。NPQ的(de)(de)(de)產生可以避免(mian)(mian)在環境脅(xie)迫(po)條件(jian)下經(jing)常觀察到的(de)(de)(de)ROS生成增加。然(ran)而，酶促和(he)非酶促抗氧化機(ji)(ji)制可以消除環境脅(xie)迫(po)條件(jian)下ROS生成的(de)(de)(de)增加。葉綠素熒光分析方法分辨率高、快速、無損、成本低，可以通過監測PSⅡ的葉綠素熒光發射來評估光化學的任何變化。該方法可以準確地確定用于光化學的能量(ΦPSⅡ)，以熱量(ΦNPQ)，或非穩壓耗散在 PSⅡ中(ΦNO)。
植物的葉綠素熒光來自吸收的光能中的一小部分重新以光的形式發射，葉綠素熒光可以用來解釋植物能量轉換相關的為光合作用活性，為光合裝置，特別是PSⅡ提供了有價值的見解。葉綠素分子（Chl）吸收光能將其轉化為激發態（Chl*），其能量較高，具體取決于用于照明的光波長。激發的葉綠素分子（Chl*）可以以兩種激發態存在：單態葉綠素分子（1Chl*），具有相對短的壽命以及壽命更長的三態葉綠素分子（3Chl*）。單線態激發態葉綠素分子（1Chl*）可以通過（i）耗散能量為熱(NPQ)，（ii）將能量轉移到另一個電子受體分子，稱為光化學（qP），或（iii）以熒光的形式重新發射為光，葉綠素熒光波長比吸收光更長。在這些途徑中，可用于去激發1Chl*的是光化學反應，它將光能轉化為電子傳遞用于合成化學產物。當光合作用高效進行時，觀察到的熒光很少。在以下情況下1Chl*不是通過上述途徑去激發的，它是從高能激發態轉換而來的1Chl* 至低能激發態3Chl*通過內部轉換或松弛。三態葉綠素分子（3Chl*）能與分子O2反應產生單氧（1O2*），一種非常活潑的活性氧（ROS）。在環境溫度下，大多數熒光來自與PSⅡ相關的葉綠素a分子。
葉綠素分子激發與能(neng)量去向(xiang)示意圖葉綠素a熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)可以(yi)使用各種方法進(jin)行(xing)檢測(ce)(ce)，例如脈(mo)沖振幅(fu)調制(PAM)方法。在開始測(ce)(ce)量(liang)之前(qian)(qian)，葉片必須經過幾分(fen)鐘(zhong)或(huo)者(zhe)幾十分(fen)鐘(zhong)的(de)(de)(de)暗(an)適(shi)應，這取決于(yu)測(ce)(ce)量(liang)前(qian)(qian)葉子所處光(guang)(guang)(guang)環境的(de)(de)(de)光(guang)(guang)(guang)強(qiang)度和(he)植物(wu)物(wu)種。黑暗(an)中葉綠素a熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)的(de)(de)(de)最(zui)小水平Fo通過低強(qiang)度測(ce)(ce)量(liang)光(guang)(guang)(guang)ML獲得，而暗(an)適(shi)應葉片的(de)(de)(de)最(zui)大(da)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)產量(liang)Fm則用飽(bao)和(he)光(guang)(guang)(guang)脈(mo)沖SP進(jin)行(xing)評估。在光(guang)(guang)(guang)化(hua)光(guang)(guang)(guang)照(zhao)明AL（即施(shi)加的(de)(de)(de)光(guang)(guang)(guang)強(qiang)度）下，可以(yi)使用另(ling)一(yi)個(ge)飽(bao)和(he)脈(mo)沖估計(ji)光(guang)(guang)(guang)適(shi)應狀態下的(de)(de)(de)最(zui)大(da)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)Fm′。在施(shi)加的(de)(de)(de)光(guang)(guang)(guang)化(hua)光(guang)(guang)(guang)AL關閉(bi)(bi)之前(qian)(qian)測(ce)(ce)量(liang)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)的(de)(de)(de)穩態水平Fs。除此之外，在關閉(bi)(bi)AL后，開可以(yi)測(ce)(ce)到另(ling)一(yi)個(ge)葉綠素熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)的(de)(de)(de)最(zui)低水平Fo′。Fm′和(he)Fo′之間的(de)(de)(de)差異(yi)是光(guang)(guang)(guang)下的(de)(de)(de)最(zui)大(da)可變熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)Fv′。根據這些測(ce)(ce)量(liang)的(de)(de)(de)基本(ben)葉綠素熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)參(can)數(shu)，可以(yi)計(ji)算出其他(ta)一(yi)些更常用于(yu)葉綠素熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)分(fen)析的(de)(de)(de)參(can)數(shu)。
脈沖振(zhen)幅調制葉綠素(su)熒光測(ce)量(liang)過(guo)程(cheng)示意圖
水(shui)分充足（對照）的擬(ni)南芥（a）和缺水(shui)脅迫開始時（對照植株土壤容積含水(shui)量的 95-96%, SWC）的擬(ni)南芥（b）葉片上開放(fang)的 PSⅡ 反應(ying)中心（qP）的差異。右側的顏色代碼表(biao)示qP值，范(fan)圍從(cong)0到1。
在0 μM（對照）、40 μM或 120 μM Cd2+ 脅迫條件下生長3天和4天的Noccaea caerulescens植株。圖中顯(xian)示了開放的(de)PSⅡ反應中心(xin)的(de)比例（qP）。右側的(de)顏色代碼(ma)顯(xian)示 qP值的(de)范圍為0.0至1.0。
Noccaea caerulescens中開放的PSⅡ反應中心部分（qP）對鎘暴(bao)露的U型雙相響應曲線。在(zai) 40 μM 的(de)(de)鎘濃度下暴露(lu)(lu)3天(tian)后，觀察(cha)到開(kai)放的(de)(de) PSⅡ 反應(ying)中心(qP)的(de)(de)比例(li)下降，而(er)暴露(lu)(lu)時間更長(4 d)后，由于誘導了應(ying)激防御(yu)反應(ying)，qP增加。同樣的(de)(de)120 μM Cd暴露(lu)(lu)時間（3天(tian)）導致qP增加。這(zhe)種激素反應(ying)被認(ren)(ren)為(wei)是(shi)由ROS水平的(de)(de)增加引(yin)發(fa)的(de)(de)，而(er)ROS 被認(ren)(ren)為(wei)有利于引(yin)發(fa)防御(yu)反應(ying)。
生物脅迫下番茄葉片的葉綠素熒光成像結果。其中每個像素的顏色代表 Spodoptera exigua 幼蟲取食前（a）和取食15分鐘后（b）番茄小葉中Fm（暗適應最大葉綠素a熒光）。(a)中用圓圈表(biao)示(shi)取(qu)食前的(de)十個(ge)感興趣(qu)區域（AOIs），(b)中為(wei)相同(tong)的(de)感興趣(qu)區域、兩個(ge)取(qu)食點(dian)（星號表(biao)示(shi)）和另外(wai)五個(ge)感興趣(qu)區域（箭頭表(biao)示(shi)）。白色(se)(se)箭頭所指的(de)取(qu)食點(dian)覆蓋了(le)整個(ge) AOI。黑色(se)(se)箭頭指向現(xian)有(you)AOI附近的(de)周圍(wei)(wei)區域。AOI 的(de)圓圈上有(you)紅色(se)(se)標簽，標注了(le)其所在位置的(de)Fm值。右側的(de)顏色(se)(se)代碼(ma)顯示(shi)Fm值的(de)范圍(wei)(wei)為(wei)0.0至0.4。
茄科植物小葉在被Spodoptera exigua幼蟲取食前（0分鐘）和取食 15、90和180分鐘后的ΦPSⅡ、ΦNPQ和ΦNO的彩色圖片。取食前的AOIs用圓圈(quan)表(biao)(biao)示，而相同的AOIs、三個取食點的AOIs（用星號和箭頭(tou)表(biao)(biao)示）以及取食區(qu)周圍的AOIs區(qu)則用圓圈(quan)表(biao)(biao)示。AOI的圓圈(quan)上還用紅色(se)標(biao)(biao)簽(qian)標(biao)(biao)注了相應的參數(shu)值(zhi)。右側的顏色(se)代碼顯示了參數(shu)值(zhi)的范(fan)圍為0.0至(zhi)0.5。
在(zai)植物(wu)(wu)(wu)表型分析(xi)中利(li)用(yong)(yong)現有(you)(you)成(cheng)像(xiang)工(gong)具(ju)具(ju)有(you)(you)巨大(da)潛(qian)力，可(ke)(ke)以加(jia)快我們對植物(wu)(wu)(wu)功能(neng)的(de)(de)(de)認識。這(zhe)些(xie)工(gong)具(ju)可(ke)(ke)以建立基因功能(neng)與(yu)環境反應之間(jian)在(zai)代謝、生(sheng)化(hua)(hua)(hua)和(he)信號轉導(dao)過程等多個途徑上(shang)的(de)(de)(de)聯系。在(zai)這(zhe)些(xie)工(gong)具(ju)中，葉(xie)綠(lv)(lv)(lv)素(su)熒(ying)(ying)光(guang)成(cheng)像(xiang)(ChlF Imaging)分析(xi)是一(yi)種(zhong)(zhong)快速(su)、非(fei)侵入(ru)性(xing)(xing)、高(gao)成(cheng)本(ben)效(xiao)益和(he)高(gao)靈敏度的(de)(de)(de)方(fang)法。這(zhe)種(zhong)(zhong)方(fang)法能(neng)精確估計(ji)光(guang)合作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)的(de)(de)(de)性(xing)(xing)能(neng)，并能(neng)檢測植物(wu)(wu)(wu)受到的(de)(de)(de)各種(zhong)(zhong)脅(xie)迫(po)影(ying)響。葉(xie)綠(lv)(lv)(lv)素(su)熒(ying)(ying)光(guang)成(cheng)像(xiang)作(zuo)(zuo)為一(yi)種(zhong)(zhong)在(zai)肉眼可(ke)(ke)見的(de)(de)(de)癥(zheng)狀出現之前(qian)檢測生(sheng)物(wu)(wu)(wu)和(he)非(fei)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)脅(xie)迫(po)的(de)(de)(de)技(ji)術(shu)，其(qi)潛(qian)力已在(zai)園藝領域(yu)得到證實，并已有(you)(you)效(xiao)地應用(yong)(yong)于(yu)采(cai)(cai)收前(qian)和(he)采(cai)(cai)收后的(de)(de)(de)各種(zhong)(zhong)情況。葉(xie)綠(lv)(lv)(lv)素(su)熒(ying)(ying)光(guang)成(cheng)像(xiang)作(zuo)(zuo)為一(yi)種(zhong)(zhong)技(ji)術(shu)，對于(yu)研究(jiu)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)和(he)非(fei)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)脅(xie)迫(po)因素(su)下葉(xie)片光(guang)合作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)的(de)(de)(de)異質性(xing)(xing)特(te)別(bie)有(you)(you)價值，而(er)且還能(neng)篩選大(da)量樣(yang)本(ben)，提供早期脅(xie)迫(po)檢測診斷。然而(er)，該領域(yu)的(de)(de)(de)進一(yi)步研究(jiu)仍然至關重(zhong)要，其(qi)最終(zhong)目(mu)的(de)(de)(de)是加(jia)快農業生(sheng)產。葉(xie)綠(lv)(lv)(lv)素(su)熒(ying)(ying)光(guang)分析(xi)方(fang)法可(ke)(ke)用(yong)(yong)于(yu)構(gou)建各種(zhong)(zhong)作(zuo)(zuo)物(wu)(wu)(wu)品種(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)綜合脅(xie)迫(po)耐受性(xing)(xing)數(shu)據(ju)庫，以便根據(ju)環境條件優化(hua)(hua)(hua)光(guang)合功能(neng)，應對氣候變(bian)化(hua)(hua)(hua)，從而(er)提高(gao)作(zuo)(zuo)物(wu)(wu)(wu)產量。在各種(zhong)葉(xie)綠(lv)素(su)熒光(guang)(guang)成像的(de)(de)參數(shu)中，開放的(de)(de)PSⅡ反(fan)應中心(xin)的(de)(de)比例（qP）被(bei)認為是(shi)最(zui)適合(he)用(yong)于早期(qi)脅(xie)迫檢測的(de)(de)指標。最(zui)近的(de)(de)研(yan)究一(yi)(yi)致發現qP具有很(hen)高的(de)(de)靈敏度，非(fei)常適合(he)用(yong)于探測光(guang)(guang)合(he)作用(yong)的(de)(de)功能(neng)，可在早期(qi)評估非(fei)生物(wu)和生物(wu)脅(xie)迫對植物(wu)的(de)(de)影響。我們(men)建(jian)議科學家在進一(yi)(yi)步的(de)(de)研(yan)究中考慮將QA 氧化還原狀態的(de)(de)葉(xie)綠(lv)素(su)熒光(guang)(guang)參數(shu)納(na)入其(qi)工(gong)作中。本(ben)研究中葉綠素(su)熒光成像的圖(tu)片由IMAGING-PAM獲得。? Moustaka, J.; Moustakas, M. . Biosensors, 2023, 13, 796.
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