Ampha Z32花粉活力分析儀的應用：評估大麻花粉的活性和數量
日期：2022-04-20 18:13:36
大(da)麻（ Cannabis sativa L.），大(da)麻科大(da)麻屬，一(yi)年生(sheng)草本(ben)植(zhi)物(wu)，廣泛種植(zhi)于(yu)亞洲、歐(ou)洲及南美(mei)等國(guo)(guo)家(jia)和地(di)區(qu)，是我(wo)國(guo)(guo)傳統(tong)的(de)纖維作物(wu)，具(ju)有重要(yao)的(de)經濟(ji)利(li)用(yong)價值，被(bei)廣泛應用(yong)于(yu)紡(fang)織、食品、造(zao)紙和建筑等多個領域。因大(da)麻中(zhong)的(de)四氫大(da)麻酚（THC）具(ju)有致幻成癮的(de)特性(xing)，故(gu)根據(ju)其含(han)量不同(tong)而被(bei)區(qu)分為工業大(da)麻（中(zhong)國(guo)(guo)THC＜0.3%，歐(ou)盟＜0.2%，美(mei)國(guo)(guo)＜0.5%）和毒品大(da)麻。大(da)(da)麻(ma)(ma)素(su)(su)是(shi)大(da)(da)麻(ma)(ma)中(zhong)特有(you)(you)的(de)(de)含有(you)(you)烷基和(he)單萜基團分(fen)子結構的(de)(de)一類次生(sheng)代(dai)謝(xie)產(chan)物(wu)(wu)，最主(zhu)要(yao)2種成(cheng)分(fen)是(shi)四氫大(da)(da)麻(ma)(ma)酚(fen)( THC) 和(he)大(da)(da)麻(ma)(ma)二酚(fen)( CBD) 。大(da)(da)麻(ma)(ma)二酚(fen)( CBD) 是(shi)非精神活性(xing)化(hua)合物(wu)(wu)，可以(yi)拮抗(kang)(kang) THC 與受體的(de)(de)結合，消除(chu)(chu) THC 對(dui)人體產(chan)生(sheng)的(de)(de)致(zhi)幻作(zuo)用，除(chu)(chu)此之外 CBD 具(ju)有(you)(you)抗(kang)(kang)炎(yan)、殺菌、鎮痛、抗(kang)(kang)焦慮、抗(kang)(kang)氧化(hua)等作(zuo)用，同(tong)時還具(ju)有(you)(you)治療(liao)精神分(fen)裂和(he)阿爾(er)茲海(hai)默癥等病癥的(de)(de)潛(qian)在醫療(liao)價值(zhi)，隨著對(dui)其藥理作(zuo)用的(de)(de)挖掘(jue)，選育(yu)高CBD含量低THC水平的(de)(de)藥用大(da)(da)麻(ma)(ma)品種以(yi)已成(cheng)為(wei)全球性(xing)的(de)(de)熱(re)點研究。但由于(yu)工(gong)業大(da)(da)麻(ma)(ma)為(wei)多為(wei)雌(ci)雄(xiong)異(yi)株植物(wu)(wu)，主(zhu)要(yao)是(shi)由雌(ci)株合成(cheng)植物(wu)(wu)大(da)(da)麻(ma)(ma)素(su)(su)、萜烯(xi)和(he)其他次生(sheng)代(dai)謝(xie)物(wu)(wu)，雄(xiong)株產(chan)生(sheng)花粉，通(tong)常(chang)大(da)(da)麻(ma)(ma)素(su)(su)濃度很(hen)低，因此藥用大(da)(da)麻(ma)(ma)的(de)(de)全雌(ci)系(xi)選育(yu)或(huo)誘雄(xiong)制種對(dui)于(yu)雌(ci)株性(xing)狀(zhuang)的(de)(de)保存具(ju)有(you)(you)極大(da)(da)的(de)(de)意(yi)義(yi)，也(ye)是(shi)目前面臨的(de)(de)一項巨大(da)(da)挑戰。全雌系誘雄過程中，鑒定花粉的活力(li)和數量（代表雄配(pei)子體(ti)的適(shi)應性）對于成功授粉至關重要。德國霍恩海姆大學的研(yan)究(jiu)(jiu)者(zhe)在(zai)本(ben)次研(yan)究(jiu)(jiu)中利用Ampha Z32花粉活力(li)分(fen)析(xi)儀（阻抗流(liu)式細胞(bao)儀，IFC）：● 評(ping)估(gu)了(le)兩種富(fu)含植物大麻素的大麻基因型(xing)KANADA（KAN）和(he)A4的花(hua)粉活力(li)（PV）和(he)花(hua)粉數量（TPC）；● 研究(jiu)了硫代硫酸銀(yin)溶液(ye)（STS）和赤霉(mei)素溶液(ye)（GA3）誘導對(dui)兩種大麻基因型PV和TPC的影響；● 研究(jiu)開(kai)花天數（DAF）對(dui)基因(yin)型內(nei)和基因(yin)型間PV和TPC的影響。結果表明，IFC法可準確測量大麻的花粉活力并有效估算花粉數量，是一種高效、可靠、無標記的測量方法，可進一步協助藥用大麻的育種策略，為大麻植物育種和種植生產開辟新的機會。—— Ampha Z32花粉(fen)活(huo)力分析儀簡介 ——
Ampha Z32花粉活(huo)力分(fen)析(xi)儀（瑞士Amphasys AG）信號的采集和(he)轉導A）細(xi)胞在不同頻率的(de)交流(liu)電(dian)場(chang)中(zhong)的(de)檢測結(jie)果(guo)，低頻下反(fan)(fan)映細(xi)胞的(de)體積特性，高頻下反(fan)(fan)映細(xi)胞膜(mo)的(de)介電(dian)特性即(ji)細(xi)胞活性；B) 微(wei)流(liu)控芯片(pian)；C）流(liu)經交流(liu)電(dian)場(chang)的(de)細(xi)胞的(de)阻(zu)抗信號（藍(lan)色實部(bu)即(ji)電(dian)阻(zu)信號，綠(lv)色虛部(bu)即(ji)容性電(dian)抗信號），細(xi)胞膜(mo)完整性決定容性電(dian)抗的(de)大小，故(gu)可通過虛部(bu)信號來(lai)區分(fen)活細(xi)胞和(he)死細(xi)胞，最(zui)終以阻(zu)抗相(xiang)位(wei)角-振幅(fu)散點圖(tu)反(fan)(fan)映出(chu)來(lai)Ampha Z32花粉(fen)活力分析(xi)儀(yi)(yi)(yi)細(xi)(xi)胞(bao)儀(yi)(yi)(yi)（瑞士(shi)Amphasys AG），通過檢(jian)測流經交流電(dian)場的細(xi)(xi)胞(bao)懸浮液中細(xi)(xi)胞(bao)的電(dian)阻抗信號，分析(xi)獲得細(xi)(xi)胞(bao)的數量、大小、活性(xing)。該儀(yi)(yi)(yi)器(qi)可以在0.3-30MHz的范圍內同時測量4個(ge)不同頻(pin)率下細(xi)(xi)胞(bao)的電(dian)阻抗特性(xing)，適(shi)配微流控芯片通道尺寸范圍為15-400μm，可滿足0-300μm范圍內的任(ren)意生(sheng)物、非生(sheng)物單細(xi)(xi)胞(bao)的活性(xing)測量。已(yi)有(you)(you)研究報(bao)道(dao)，硫代(dai)硫酸(suan)銀(yin)溶(rong)液(ye)（STS）和赤(chi)霉素溶(rong)液(ye)（GA3）可(ke)通過與乙烯激素競爭誘(you)導(dao)全雌系植(zhi)株雄(xiong)(xiong)花(hua)形成并開花(hua)，本實驗研究了KAN和A4兩種基因型大麻經(jing)這兩種誘(you)雄(xiong)(xiong)激素誘(you)導(dao)開花(hua)后(hou)的(de)(de)第(di)11、14、18、21和24天（DAF）所(suo)收獲的(de)(de)雄(xiong)(xiong)花(hua)數(shu)(shu)。實驗結(jie)果顯(xian)示，所(suo)有(you)(you)經(jing)GA3和STS溶(rong)液(ye)處(chu)理的(de)(de)植(zhi)株都(dou)產生了雄(xiong)(xiong)花(hua)，且植(zhi)株雄(xiong)(xiong)花(hua)數(shu)(shu)量均(jun)隨時間推移而增加(jia)(jia)，這表(biao)明誘(you)雄(xiong)(xiong)激素和開花(hua)天數(shu)(shu)的(de)(de)交互作用對雄(xiong)(xiong)花(hua)數(shu)(shu)量有(you)(you)顯(xian)著(zhu)影(ying)響（表(biao)1）。相較于DAF前期(qi)，DAF后(hou)期(qi)雄(xiong)(xiong)花(hua)數(shu)(shu)量的(de)(de)增加(jia)(jia)更為(wei)顯(xian)著(zhu)，其中GA3處(chu)理的(de)(de)植(zhi)株在24DAF的(de)(de)單株雄(xiong)(xiong)花(hua)數(shu)(shu)最(zui)高，為(wei)220.60；STS處(chu)理的(de)(de)植(zhi)株在24DAF的(de)(de)單株雄(xiong)(xiong)花(hua)數(shu)(shu)最(zui)高為(wei)273.33（圖1a）。
圖1 在開花第(di)11、14、18、21天（DAF）收獲的雄(xiong)花數a）赤霉素(su)（GA3）和硫(liu)代硫(liu)酸(suan)銀溶液（STS）處理；b）兩種基因型KAN和A4。此(ci)外，基(ji)因(yin)型(xing)和(he)DAF的交互作用同樣(yang)顯(xian)著影響植株(zhu)雄(xiong)(xiong)花數(shu)(shu)量(liang)（表(biao)1），即(ji)基(ji)因(yin)型(xing)KAN和(he)基(ji)因(yin)型(xing)A4的雄(xiong)(xiong)花數(shu)(shu)量(liang)均隨(sui)采樣(yang)時(shi)間的推移而增(zeng)加，其中基(ji)因(yin)型(xing)KAN在(zai)24DAF產生的雄(xiong)(xiong)數(shu)(shu)量(liang)最(zui)高(gao)，為189.74；基(ji)因(yin)型(xing)A4在(zai)11、21、24DAF的雄(xiong)(xiong)花數(shu)(shu)量(liang)顯(xian)著高(gao)于(yu)基(ji)因(yin)型(xing)KAN，且(qie)在(zai)24DAF的雄(xiong)(xiong)花數(shu)(shu)量(liang)最(zui)多，達到317.78（圖1b）。表1 每(mei)株雄花數(shu)、花粉細胞總數(shu)（TPC）和花粉活力（PV）的(de)性狀方差分析表
不(bu)同誘雄激素下，不(bu)同開花天數的花粉(fen)細胞總數（TPC）如(ru)圖2所示(shi)，GA3誘(you)導(dao)(dao)(dao)下(xia)植(zhi)株的(de)(de)平均TPC僅為850-1500，而STS誘(you)導(dao)(dao)(dao)下(xia)植(zhi)株的(de)(de)平均TPC在8-14DAF呈(cheng)上升趨勢，并在14DAF達到最高（1.54×105），隨后逐漸下(xia)降，在24DAF時最低（6.67×104），總體而言，STS所誘(you)導(dao)(dao)(dao)植(zhi)株產生的(de)(de)TPC大(da)約(yue)是GA3誘(you)導(dao)(dao)(dao)下(xia)的(de)(de)100倍，可見兩(liang)(liang)種誘(you)雄激素下(xia)的(de)(de)平均TPC存在顯著差異(yi)，但兩(liang)(liang)個基因型間的(de)(de)平均TPC并未發現(xian)顯著差異(yi)（表1）。
圖2 赤霉素（GA3）和硫代硫酸銀（STS）誘導開花(hua)后(hou)的不同天數(shu)產生的平均花(hua)粉細胞(bao)總(zong)數(shu)（TPC）花粉數量可能是(shi)提高(gao)(gao)雜交種(zhong)(zhong)子(zi)產(chan)量的(de)(de)(de)關鍵性狀之(zhi)一，但(dan)在(zai)以往確定(ding)雌株(zhu)大(da)麻(ma)誘雄(xiong)效(xiao)(xiao)率的(de)(de)(de)研究(jiu)中，卻并未考慮花粉數量。在(zai)本次研究(jiu)的(de)(de)(de)采(cai)樣期間內，兩種(zhong)(zhong)誘雄(xiong)激素處(chu)理下(xia)的(de)(de)(de)兩種(zhong)(zhong)基(ji)因型(xing)的(de)(de)(de)雄(xiong)花數量差(cha)異均不(bu)顯(xian)著，但(dan)TPC差(cha)異顯(xian)著，STS處(chu)理產(chan)生的(de)(de)(de)花粉細胞數量明顯(xian)高(gao)(gao)于GA3。因此在(zai)大(da)麻(ma)育(yu)種(zhong)(zhong)過程中，通過STS可誘導雄(xiong)花并產(chan)生足夠數量的(de)(de)(de)花粉供授粉，可有效(xiao)(xiao)減(jian)少(shao)雄(xiong)株(zhu)的(de)(de)(de)種(zhong)(zhong)植比例，且從(cong)花粉數量推斷14-18DAF可能是(shi)理想的(de)(de)(de)采(cai)粉窗口期。不(bu)同誘雄激素下，不(bu)同開(kai)花(hua)天(tian)數(shu)的花(hua)粉活力（PV）如(ru)表1所(suo)示，基(ji)因(yin)型(xing)(xing)(xing)、誘(you)雄激素(su)類型(xing)(xing)(xing)以及(ji)開(kai)花(hua)天數（DAF）的(de)交互作用顯著影響花(hua)粉活性（PV）。相(xiang)較(jiao)于STS處理(li)，兩種基(ji)因(yin)型(xing)(xing)(xing)在(zai)GA3處理(li)下(xia)的(de)PV在(zai)所(suo)有(you)DAF內(nei)都較(jiao)低，但差異大(da)小(xiao)各不相(xiang)同。STS處理(li)下(xia)，基(ji)因(yin)型(xing)(xing)(xing)A4在(zai)18DAF的(de)PV最(zui)大(da)（79.36%），但與(yu)14 (77.88%)、21 (71.33%) 和 24 (51.92%) DAF的(de)PV無顯著差異，8(45.66%)和11(53.86%)DFA的(de)PV較(jiao)低（圖(tu)3a）；而(er)(er)基(ji)因(yin)型(xing)(xing)(xing)KAN在(zai)11DAF的(de)PV最(zui)大(da)（78.18%），與(yu)8 (71.23%)、14 (77.22%)、18 (67.20%) 和 21 (70.43%) DAF的(de)PV沒有(you)顯著差異，但24 (36.49%)DAF的(de)PV明顯下(xia)降。GA3處理(li)下(xia)，基(ji)因(yin)型(xing)(xing)(xing)A4的(de)PV在(zai)11（34.90%）DAF最(zui)高(gao)，24 (14.88%) DAF最(zui)低；而(er)(er)基(ji)因(yin)型(xing)(xing)(xing)KAN的(de)PV在(zai)14（24.24%）DAF最(zui)高(gao)，8DAF最(zui)低，僅為0.63%（圖(tu)3b）。
圖3 基(ji)因型(xing)（a）A4和(he)（b）KAN在GA3和(he)STS處(chu)理下(xia)的(de)花粉活性力(li)（%）花(hua)粉(fen)活(huo)力(li)對溫(wen)度和濕度極其敏感，IFC法(fa)可(ke)在收獲花(hua)粉(fen)后立即測量花(hua)粉(fen)活(huo)力(li)，避免長時(shi)間暴露于環(huan)境壓力(li)所導致的(de)花(hua)粉(fen)活(huo)力(li)受損，可(ke)有(you)效(xiao)指導花(hua)粉(fen)收獲的(de)最佳時(shi)間。本次研(yan)究結果表明，8-24DAF為大麻花(hua)粉(fen)收獲的(de)窗(chuang)口期(qi)，利(li)用這17天的(de)窗(chuang)口期(qi)靈活(huo)調整雌花(hua)開(kai)花(hua)的(de)同步性，可(ke)有(you)效(xiao)提高(gao)大麻育種(zhong)中的(de)授(shou)粉(fen)成(cheng)功(gong)率。
