最近幾年(nian)，基于對綠藻和藍細菌的一些測(ce)量(liang)結(jie)果，打破了我(wo)們長(chang)期認為(wei)的光(guang)合生(sheng)物體內可變熒光(guang)完全來(lai)自光(guang)系統II的認知范式(shi)。通過比(bi)較光(guang)誘導的Fv＞700 nm和Fv＜710 nm的變化可以(yi)用(yong)來(lai)鑒定Fv(I)。強光(guang)誘導的Fv(I)在Fv＞700 nm時比(bi)在Fv＜710 nm時約大1.5倍。近(jin)期Ulrich Schreiber教授(shou)發表在(zai)Photosynthesis Research上的新研究成果以模式綠藻小(xiao)球藻(Chlorella vulgaris)為(wei)研究(jiu)對象，通(tong)過比(bi)較遠紅光(guang)(720 nm，大(da)部分被(bei)(bei)PSI吸收(shou)(shou))和(he)(he)可見光(guang)(540 nm，被(bei)(bei)PSI和(he)(he)PSII吸收(shou)(shou))激(ji)發的光(guang)誘導長波熒光(guang)(＞765 nm)變化，進(jin)一(yi)步擴展了該(gai)方(fang)面的工作。該研究測量了由540 nm飽和光引起的可變熒光(Fv)多相上升曲線，將初始O-I1上升相歸一化后，假定反映Fv(II)，結果顯示出720 nm激發(720 ex)的 I2-P瞬態比540 nm激發(540 ex)的高2倍的。分析Fo(I)對Fo(720 ex)和Fo(540 ex)的貢獻發現，Fo(I)720 ex比Fo(I)540 ex高2倍，這支持了整個I2-P瞬變是由Fv(I)引起的觀點。F(I)/F(II)的激發比從 680 nm 到 720 nm 的兩倍增加遠小于作用光譜已知的PSI/PSII 的八到十倍增加。有人認為，測得的F＞765 nm并不代表PSI的大部分葉綠素，而是反映了一小部分具有吸收遠紅光特性的葉綠素形式(“red Chls”)。另外，基于相同的方法，即比較用720 ex和540 ex測量的多相上升曲線，Fv(I)也被證實普遍存在于其他各種光合生物中，如藍細菌、苔蘚、蕨類植物、高等植物葉片。
上述研究結果是由德國伍茲堡大(da)學教授Ulrich Schreiber使用(yong)多激(ji)發波(bo)長調制(zhi)葉(xie)綠素熒(ying)光(guang)(guang)儀Multi-Color-PAM和(he)雙(shuang)通道葉(xie)綠素熒(ying)光(guang)(guang)儀DUAL-PAM-100組合的(de)(de)測量系(xi)統(tong)做出的(de)(de)。文章于(yu)2023年1月4日發表(biao)在光(guang)(guang)合作用(yong)專業期(qi)刊Photosynthesis Research上，標(biao)題(ti)為“Light-induced changes of far-red excited chlorophyll fluorescence: further evidence for variable fluorescence of photosystem I in vivo”。在本研究中Multi-Color-PAM充分發揮(hui)了它出色靈(ling)敏度與卓越(yue)時(shi)(shi)間分辨(bian)率(10 μs)相結合的(de)(de)特(te)點，同時(shi)(shi)它還具(ju)有多個波(bo)長的(de)(de)激(ji)發光(guang)(guang)，非常適合于(yu)研究光(guang)(guang)系(xi)統(tong)捕(bu)光(guang)(guang)天(tian)線尺寸，反應(ying)中心(xin)關(guan)閉(bi)和(he)開放，以及類(lei)胡(hu)蘿卜素自(zi)由基參與進行(xing)的(de)(de)快(kuai)速高(gao)光(guang)(guang)強淬滅(mie)(HIQ)。
2021年初Ulrich Schreiber教(jiao)授(shou)曾在Photosynthesis Research上發表過(guo)(guo)一篇題(ti)為(wei)Evidence for variable chlorophyll fluorescence of photosystem I in vivo的文章。研究了(le)(le)(le)綠(lv)色(se)單細(xi)胞(bao)藻(zao)類小球藻(zao)、藍藻(zao)聚球藻(zao)和淡綠(lv)色(se)常春藤葉片，呈(cheng)現(xian)的結果為(wei)體(ti)內存在可變(bian)PS I熒光(guang)(guang)Fv(I)提供(gong)了(le)(le)(le)強有力的證(zheng)據。這次通(tong)過(guo)(guo)測(ce)量遠(yuan)紅光(guang)(guang)激發誘(you)導葉綠(lv)素熒光(guang)(guang)的變(bian)化無疑為(wei)活體(ti)內存在光(guang)(guang)系統(tong)I可變(bian)熒光(guang)(guang)進(jin)一步提供(gong)了(le)(le)(le)新的證(zheng)據。(往(wang)期(qi)推文：)
使(shi)用遠紅光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)(FR，優選(xuan)720 nm)或可見光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)(優選(xuan)540 nm)脈(mo)沖調制激發(fa)檢測(ce)單(dan)元(yuan)比較測(ce)量(liang)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)誘(you)導葉綠素熒光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)產(chan)量(liang)變化的(de)(de)(de)實(shi)驗裝置(zhi)框架圖(tu)。光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)學單(dan)元(yuan)的(de)(de)(de)幾何形狀(zhuang)針對(dui)兩(liang)種(zhong)類型的(de)(de)(de)測(ce)量(liang)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)(ML)以及540 nm光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)化光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)(AL)和多周轉閃光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang) (MT)的(de)(de)(de)均勻照明進(jin)行了優化。脈(mo)沖調制熒光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)的(de)(de)(de)相對(dui)產(chan)率(lv)是用由PamWin-3軟件控制的(de)(de)(de)Multi-Color-PAM熒光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)儀測(ce)量(liang)的(de)(de)(de)。定制的(de)(de)(de)540 nm LED陣(zhen)列(lie)由DUAL-PAM-100的(de)(de)(de)控制單(dan)元(yuan)(DUAL-C)供電，并通過(guo)從(cong)MC-PAM獲得(de)的(de)(de)(de)預編(bian)程觸發(fa)信號(hao)進(jin)行控制。
使用720 nm(紅線(xian)，720ex)和(he)540 nm(藍線(xian)，540ex)脈沖調(diao)制測量(liang)光(guang)測量(liang)暗適應的(de)小(xiao)球藻懸浮液(ye)得(de)到的(de)多相熒光(guang)上升曲線(xian)。熒光(guang)從I1-P的相變(bian)，720ex大于(yu)(yu)540ex。在(zai)MT誘導過程中，兩個信(xin)號之間的差異(yi)在(zai)2 ms內(nei)保(bao)持在(zai)675 mV，然后在(zai)上(shang)升到P點(dian)期間增加到755 mV。由于(yu)(yu)720ex的PSI/PSII激發(fa)比毋庸置疑的高于(yu)(yu)540ex，這意味著上(shang)升P點(dian)的部(bu)分熒光必須來自(zi)PSI，因此反映了(le)Fv(I)。
使用720 nm脈沖調制激發測(ce)量的(de)(de)多(duo)相熒光上升(sheng)曲線，將(jiang)Fo反(fan)卷積(ji)為Fo(I)和Fo(II)的(de)(de)貢獻。Fo(540ex)由35%Fo(I)和65%Fo(II)組成，Fo(720ex)由52%Fo(I)和48%Fo(II)組成。540ex的(de)(de)Fo(I)/Fo(II) = 35/65 = 0.539，而720ex的(de)(de)為52/48 = 1.083。因(yin)此，720ex的(de)(de)Fo(I)/Fo(II)比率恰好比540ex大2倍(bei)。因(yin)此，Fv(I)/Fv(II)的(de)(de)比率也應比720ex比540ex高(gao)2倍(bei)。
暗適應后(PQ庫部(bu)分還原)小球(qiu)藻(zao)全部(bu)Fv(720ex)多相上(shang)升動力學的Fv(I)和(he)Fv(II)組分的反卷(juan)積。
在弱FR背景光(PQ庫預(yu)氧化(hua))存在下，全部(bu)Fv(720ex)動力學的Fv(I)和Fv(II)分量的反卷積。
小(xiao)球藻540ex和680ex(圖a)，700ex(圖b)，720ex(圖c)的多相(xiang)上升動(dong)力學(xue)。680 nm以上的激發波長(chang)下顯示出“額(e)外的Fv(I)”。
小球藻中“額(e)外(wai)Fv(I)”的(de)信息源自(zi)使用540ex 和紅光(guang)(guang)(guang)-光(guang)(guang)(guang)紅光(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)譜(pu)范(fan)圍內的(de)各種激(ji)發(fa)波長對(dui)多相上升動力學的(de)比(bi)較測量。a: “額(e)外(wai)Fv(I)”的(de)動力學。b “額(e)外(wai)Fv(I)”的(de)振幅與紅光(guang)(guang)(guang)-光(guang)(guang)(guang)紅光(guang)(guang)(guang)激(ji)發(fa)波長的(de)函數。“額(e)外(wai)的(de)Fv(I)”被縮(suo)放為(wei)O-I1振(zhen)幅的分數。
使用720ex(紅線)和540ex(綠線)測量的 3 種(zhong)不同(tong)強(qiang)度的540 nm光(guang)化(hua)照明(ming)開(kai)始時的暗-光(guang)熒光(guang)誘導(dao)動力(li)學(xue)曲線探(tan)究Fv(I)對光(guang)化(hua)強(qiang)度的依賴性。
0.1 μM DCMU(a)和1 μM DCMU(b)對用720ex和540ex測量的多相上升動(dong)力(li)學曲線的影響。
不同光合生物各自720ex和540ex 測量的(de)Fv值(zhi)之間(jian)的(de)差異。這些結果只是為(wei)了證明(ming)光合生物中(zhong)“額外Fv(I)”現象的(de)普(pu)遍性。Fv(I)對解(jie)釋多(duo)相上升動力(li)學的(de)意義(yi)截至目前，強光化光引起熒光產率的多相上升動力學幾乎完全根據Fv(II)來解釋。雖然人們普遍認為“光化學”O-I1(或O-J)相反映了PSII反應中心關閉時的Fv(II)，但“熱”I1-I2-P(或J-I-P)相對此則給出了完全不同的解釋。隨著研究人員的新證據證明I2-P相反映了小球藻中的Fv(I)，我們必須重新考慮以前對多相上升動力學這部分的解釋。至于前面的I1-I2階段，新的文章以及Schreiber和Klughammer 2021的文章中提供的數據清楚地表明它反映了Fv(II)，這就提出了I1相對于I2 的淬火性質問題。文獻中討論了涉及PSⅡ受體和供體側、氧化的PQ以及PSII 反應中心水平的“構象”變化的許多機制。一個關鍵觀察結果是DCMU消除了這種猝滅。支持Schansker 等人的早期結論。基于 PSII 構象變化的淬火機制受到Magyar 等人的青睞。他們基于的結果是在DCMU存在的情況下對閃光引起的熒光上升的測量。在這些研究中，在飽和的1.5 μs閃光后達到中間熒光產率 F1，并且只有大量這樣的閃光才能達到最大熒光產率 Fm。從 F1 到 Fm 的轉變被認為反映了光化學誘導的蛋白質構象變化，這種變化在體內“對大部分Fv 負責”。鑒于本研究的結果，這種 Fv 對從 Fo 到 Fm(或 P)的整體增加的貢獻似乎僅適用于 I1-I2階段。然而，這不僅可以通過 DCMU 消除，而且還可以通過在黑暗中預還原 PQ 池來很大程度上抑制。前面得一幅圖中，P、I1和“額外Fv(I)”的振幅分別為1.63、1.00 和 0.31。假設在小球藻中 Fv(I) = 2ד額外的 Fv(I)”幾乎沒有 I1-I2可能與 Fv 由于光驅動的構象變化有關。然而，不能排除當PQ庫在黑暗中還原時會引起構象變化。任何進一步嘗試回答I1和 I1-I2相淬火的起源都超出了本通訊的范圍。Fv(I)的(de)存在對淬滅(mie)分析的(de)影響在實際應用中，飽和脈沖猝滅分析具有特殊的價值，因為它可以評估樣品在給定光照狀態下的光合狀態。在這些條件下，Fd下游的反應被光激活，Fv(I)的干擾被最小化。然而，當在暗適應后測量最大Fv/Fm時，需要特別注意，其中Fv和Fm的值包含大量的I2-P分量，因此也包含大量的Fv(I)。這個問題可以通過適應低強度背景照明來代替嚴格的暗適應來避免。預光照應激活 Fd下游的反應，而不會引起顯著的能量依賴性非光化學猝滅NPQ。由此產生的 I2-P抑制不可避免地導致較低的Fv/Fm值。另一方面，當修正F(I)對Fo的貢獻時，會獲得更高的Fv/Fm值。當忽略Fv(I)的存在時，這可能會導致對光誘導熒光變化的誤解。例如，非光化學猝滅(NPQ)通常參考暗適應后測量的 Fm 狀態進行量化。當在中等光強度下照射時，最大熒光產量Fm'相對于Fm下降，這正式導致NPQ增加，而實際上Fm'的下降是由于光激活抑制I2-P相 PSI下游的反應。在NPQ的定量研究中應考慮到這一方面，方法是將暗適應后的 I2水平而不是Fm水平作為參考。為(wei)什么Fv(I)沒有(you)更早被發現(xian)？90多(duo)年前，當(dang)Hans Kautsky發(fa)現可變Chl熒(ying)光(guang)(guang)(guang)時(shi)(shi)，當(dang)時(shi)(shi)還沒有關于(yu)存(cun)在(zai)(zai)兩(liang)個(ge)(ge)光(guang)(guang)(guang)系統的(de)(de)(de)信息。此類(lei)信息在(zai)(zai)30年后逐漸出現，Chl熒(ying)光(guang)(guang)(guang)被(bei)證(zheng)明(ming)是(shi)(shi)(shi)闡明(ming)PSII中(zhong)水的(de)(de)(de)分(fen)裂與PSI受體側(ce)NADP還原(yuan)(yuan)之間的(de)(de)(de)各種電子(zi)(zi)傳輸步驟的(de)(de)(de)先驅工(gong)具。雖然(ran)很明(ming)顯部分(fen)熒(ying)光(guang)(guang)(guang)源自PSI，但(dan)人們認為這是(shi)(shi)(shi)恒定的(de)(de)(de)，僅對(dui)暗(an)熒(ying)光(guang)(guang)(guang)Fo 有貢(gong)獻。我們現在(zai)(zai)知道，與Fv(II)相(xiang)比(bi)，Fv(I)的(de)(de)(de)振幅確實很小。此外，Fv(I) 僅在(zai)(zai)相(xiang)對(dui)較短的(de)(de)(de)時(shi)(shi)間窗口(20到(dao)200毫秒(miao))內用(yong)飽和光(guang)(guang)(guang)照(zhao)射(she)時(shi)(shi)瞬態發(fa)展。最后但(dan)同樣(yang)重要的(de)(de)(de)是(shi)(shi)(shi)，Fv(I)在(zai)(zai)連續光(guang)(guang)(guang)照(zhao)和DCMU 存(cun)在(zai)(zai)下被(bei)抑(yi)制。雖然(ran)DCMU通過阻斷二次電子(zi)(zi)傳輸在(zai)(zai)PSII初級反應(ying)的(de)(de)(de)研究(jiu)中(zhong)非常(chang)有價值，但(dan)PSI不存(cun)在(zai)(zai)類(lei)似的(de)(de)(de)抑(yi)制劑。據推測，這是(shi)(shi)(shi)迄今為止Fv(I)尚未被(bei)強大的(de)(de)(de)時(shi)(shi)間分(fen)辨熒(ying)光(guang)(guang)(guang)測量(liang)技術(shu)檢(jian)測到(dao)的(de)(de)(de)主要原(yuan)(yuan)因(yin)，在(zai)(zai)過去(qu)的(de)(de)(de)30年中(zhong)，該技術(shu)已應(ying)用(yong)于(yu)許多(duo)研究(jiu)兩(liang)個(ge)(ge)光(guang)(guang)(guang)系統吸收的(de)(de)(de)激發(fa)能的(de)(de)(de)命運 。原(yuan)理上，衰變相(xiang)(xiang)關光(guang)(guang)譜(DAS)允許(xu)對體內(nei)Chl熒光(guang)(guang)的(de)特性進行詳細和(he)準確(que)(que)的(de)分析。PSI和(he)PSII熒光(guang)(guang)的(de)貢獻可(ke)(ke)以(yi)很容易地根據它們(men)截(jie)然(ran)不同的(de)壽(shou)(shou)命(ming)(ming)和(he)衰變相(xiang)(xiang)關的(de)激發和(he)發射(she)光(guang)(guang)譜來區分。然(ran)而，當(dang)作(zuo)為檢(jian)測(ce)Fv(II)的(de)常(chang)規做(zuo)法添(tian)加PSII抑制劑(ji)DCMU時(shi)(shi)，Fv(I)被(bei)(bei)(bei)有效(xiao)阻止(zhi)(zhi)。當(dang)PSI下游的(de)反應(ying)被(bei)(bei)(bei)預光(guang)(guang)照(zhao)光(guang)(guang)激活時(shi)(shi)，Fv(I)的(de)誘導(dao)也會(hui)被(bei)(bei)(bei)阻止(zhi)(zhi)。暗適(shi)應(ying)后，必須應(ying)用(yong)非(fei)常(chang)強的(de)多(duo)次周轉光(guang)(guang)脈沖以(yi)確(que)(que)保(bao) PSI(鐵氧(yang)還(huan)蛋白(bai))受體側的(de)限制關閉，然(ran)后通(tong)(tong)過(guo)光(guang)(guang)激活再次打開，這在藻類(lei)和(he)藍藻中(zhong)特別快。另一方面，由(you)于可(ke)(ke)以(yi)預期Fv(I) 的(de)壽(shou)(shou)命(ming)(ming)比 Fo(I) 的(de)壽(shou)(shou)命(ming)(ming)長(chang)得多(duo)，并且相(xiang)(xiang)對于Fv(II) 應(ying)該有相(xiang)(xiang)當(dang)大的(de)紅移，因此(ci)可(ke)(ke)以(yi)通(tong)(tong)過(guo)時(shi)(shi)間確(que)(que)認其存在。當(dang)滿足上述要(yao)求時(shi)(shi)，分辨測(ce)量(liang)應(ying)該不會(hui)太困難。1、Multi-Color- PAM 熒(ying)光儀被(bei)擴展用(yong)(yong)于使用(yong)(yong) FR 脈沖調制(zhi)測(ce)量(liang)光測(ce)量(liang)暗光 Chl 熒(ying)光誘(you)導動力(li)學(xue)。2、使用該(gai)測量系(xi)統，首次在波長> 765 nm處(chu)測量了PSI熒光激發F(I)的多相上升動力(li)學。3、對(dui)原始720ex 信(xin)號中包(bao)含(han)的(de)(de)(de)相(xiang)對(dui)較(jiao)大的(de)(de)(de)恒定(ding)(ding)(ding)背景(jing)信(xin)號進(jin)行量化和校正(zheng)，因此不僅(jin)可(ke)以(yi)(yi)獲取有關Fv(I) 的(de)(de)(de)定(ding)(ding)(ding)量信(xin)息，還(huan)可(ke)以(yi)(yi)獲得有關 Fo(I) 的(de)(de)(de)定(ding)(ding)(ding)量信(xin)息。4、按照 Schreiber 和Klughammer (2021) 介紹的方法，重新調整 720ex 和540ex 響應，使其 O-I1振幅相等，因此所有F(II) 響應均等。5、從O-I1均衡Fv(720ex)和Fv(540ex) 響應之間的差異，推導出選擇性Fv(I)響應，對應于720ex 與 540ex相比觀察到的“額外Fv(I)”。6、分析Fo(I)和(he)Fo(II)對Fo(720ex)和(he)Fo(540ex)的(de)貢獻(xian)表明，在暗適應(ying)的(de)小球藻中，720ex的(de)Fo(I)/Fo(II)比值比540ex高兩倍，假(jia)設Fo(I)/Fo(II) = 35/65與540ex 的(de)合理比率。7、假(jia)設Fv(I)/Fv(II)與720ex的(de)(de)比率超過540ex的(de)(de)2倍，推斷在(zai)暗適應(ying)的(de)(de)小球藻中(zhong)，Fv(720ex)中(zhong)包含的(de)(de)Fv(I)總(zong)計2倍“額外的(de)(de)Fv(I)”。8、基于此Fv(I)信息，對Fv(II)動力學進行了解卷積，它與原始Fv(720ex)動力學非常匹配，直至約20 ms，Fv(I) 開始發展。此后，Fv(II)開始飽和，而Fv(I)在約200 ms時顯示瞬態峰值。數據支持 I2-P(或 I-P)階段歸因于Fv(I) 的觀點。9、正如在小球藻中，取決于實驗條件，不能始終區分不同的 I2階躍或拐點，I2水平被定義為P和I2水平之間的差異等于Fv(I)振幅，即測量的“額外Fv(I)。”10、在較低光化強度下使用720ex和540ex進行的暗光感應動力學比較測量表明，當無法區分I1和I2水平時，一些Fv(I) 也隱藏在“經典”考茨基效應(O-I-P-S 瞬態)的峰值中。11、發現 DCMU 可以“從上方”抑制I2-P相位，這與最大 F(II) 由I2而不是 P(或 Fm)指示的結論一致。12、使用540ex 和680-740 nm范圍內的(de)(de)各種激發波長的(de)(de)比較測量表明，“額外的(de)(de) Fv(I)”在(zai)波長?> 680 nm 時產生，并在(zai)約720 nm 處達到峰值。13、雖(sui)然Fv(I)在(zai)“紅降”光(guang)譜(pu)范圍(wei)內的(de)(de)發展(zhan)定(ding)性(xing)地與眾所(suo)周(zhou)知的(de)(de)PSI/PSII激發從PSI和PSII 作用光(guang)譜(pu)中增加一致，但觀察(cha)到(dao)F(I)/F(II)激發比率的(de)(de)2倍(bei)系數和有效PSI/PSII 活(huo)性(xing)的(de)(de)8-10 倍(bei)系數存在(zai)明顯差異。提出了“紅色(se) Chls”在(zai)確定(ding)在(zai)波(bo)長?> 765 nm 時測量的(de)(de)F(I) 和 F(II) 特性(xing)中的(de)(de)可能作用。14、重新審視了Schreiber 和 Klughammer (2021)中的F > 700與F < 710數據，其中F < 710 響應中相對較大的I2-P振幅似乎反映了“太多”F(I) <; 710。精細分析 這些數據顯示Fo(I) > 700/Fo(I) < 710 = Fv(I)?> 700/Fv(I) < 710 = 1.48，當激發比F(I)/F(II) = 假設F < 710 為 35/65。得出結論，活體內F < 710確實包含比通常假設更多的F(I)，這與過去10年許多實驗室發表的報告一致，即LHCII是PSI天線系統的組成部分。15、使用 720ex 和540ex 對各種不同的光合生物進行的比較測量表明，所有這些生物中都有大量“額外的Fv(I)”。在藍藻中發現了一個特別大的“額外 Fv(I)”(幾乎與 O-I1相一樣大)，因此似乎特別適合在體內進一步研究Fv(I)。—— 參考(kao)文獻 ——
1、Schreiber, U. . Photosynth Res (2023).
2、Schreiber, U., Klughammer, C. . Photosynth Res 149, 213–231 (2021).
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