? 將自動流(liu)式細胞(bao)儀與圖像處理的細胞(bao)圖像流(liu)相結合，可以估算(suan)藻細胞(bao)生長率(lv); ? 凱倫藻（Karenia selliformis）在赤潮期間表現出低生長率; ? 在藻華期間，Karenia selliformis可能存在磷限制; ? 潮汐動態在Karenia selliformis生物量積累中起著關鍵作用。
2019年秋季，在加貝斯灣（地中海）發生了一次凱輪藻（Karenia selliformis）赤潮事件，利用配備流動成像模塊的自動流式細胞儀（Cytosense, Cytobuoy b.v.）進行了為期9天的高頻監測。該儀器記錄了光學信號的形狀，從而分辨了有害藻類大量繁殖期間的六個細胞群，包括微微型浮游植物 (picophytoplankton)，微型浮游植物 (nanophytoplankton)和小型植物型浮(fu)游植(zhi)物 (microphytoplankton)。通過分析每小時記錄得到的凱輪藻細胞尺寸，估算了赤潮期間的日分裂率。結果顯示，凱倫藻是唯一形成赤潮的物種，并在調查的第四天達到了最高的平均豐度。營養鹽組成發生了變化，赤潮爆發期可能存在磷（P）限制，而大赤潮衰退期可能存在氮（N）限制。協慣量分析顯示，凱倫藻和異養原核生物呈相反的模式，表明了它們之間的營養相互作用以及赤潮結束時凱倫藻可能出現混合營養行為。凱倫藻的生長率普遍較低，通常日分裂率<1/d，此數值無法解釋觀察到的高豐度。潮汐在半日和春潮-露潮尺度上對凱倫藻動態起著至關重要的作用，并可能增強了凱倫藻的積累。在(zai)這項(xiang)研究中，報告(gao)了對加(jia)貝(bei)斯灣中凱倫藻(zao)進行高(gao)頻率(lv)原(yuan)位監測的結果。以(yi)小時為單位時間尺度(du)對赤(chi)(chi)潮(chao)(chao)動態進行了調查，以(yi)解決以(yi)下問題(ti)：（1）觀察到的赤(chi)(chi)潮(chao)(chao)是(shi)(shi)(shi)(shi)否(fou)為單一(yi)種類，并且是(shi)(shi)(shi)(shi)否(fou)與(yu)其他浮游植物群體，尤其是(shi)(shi)(shi)(shi)超微型浮游植物（<10 μm），存在(zai)相互(hu)作用？（2）凱倫藻(zao)在(zai)赤(chi)(chi)潮(chao)(chao)期(qi)(qi)間的養分需(xu)求是(shi)(shi)(shi)(shi)什么，赤(chi)(chi)潮(chao)(chao)期(qi)(qi)間養分組成是(shi)(shi)(shi)(shi)否(fou)發生(sheng)了變化？（3）在(zai)赤(chi)(chi)潮(chao)(chao)期(qi)(qi)間，高(gao)生(sheng)物量是(shi)(shi)(shi)(shi)否(fou)由純物理過程維(wei)持，還是(shi)(shi)(shi)(shi)由于種群的內在(zai)固有特征（即，高(gao)生(sheng)長(chang)率(lv)）？取樣是在2019年秋季（從9月27日至10月5日）在突尼斯斯法克斯（Sfax）的商業港口進行的，此前當地政府報告了水體變色情況。斯法克斯港口位于加貝斯灣北岸的工業區域內，該地區是突尼斯海岸沿線赤潮事件的主要熱點區域（見圖1）。大多數事件發生在秋季和春季，而主要的有害赤潮物種是凱倫藻屬（Karenia selliformis）（Feki等人，2017年）。盡管屬于東地中海盆地寡營養區，但加貝斯灣非常富有生產力，占突尼斯漁業生產的65％（DGPA，2005–2009）。它是海龜的知名棲息地（Jribi等人，2008年；Lotze和Worm，2009年；Maffucci等人，2006年）。盡管加貝斯灣對當地經濟和野生動物保護具有特殊重要性，但仍然受到城市化、工業、漁業、旅游和人為排放的強大壓力（B′ejaoui等人，2004年；Ben Brahim等人，2010年；Rekik等人，2012年）。
采樣使用手持式多參數儀器（WTW Multi 340i/SET）對溫度、鹽度和pH進行了每小時的測量。潮汐振幅，即高潮和落潮之間的差異，被視為表示潮汐影響的變量，從位于斯法克斯港口的潮汐測站獲取，由突尼斯海洋水文和海洋服務部門運營。從3米深處使用一臺5馬力的潛水電泵連續將港口的亞表層海水泵入。每3小時收集一次營養分析樣品，裝入清潔的50 cm3聚碳酸酯瓶中，并立即存放在-80°C。1. 采(cai)用(yong)(yong)(yong)(yong)高(gao)頻率(lv)采(cai)樣（1小時(shi)間隔）模(mo)式(shi)來監測浮(fu)游植物動態。使(shi)(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)了(le)Cytosense自動流(liu)(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)儀（Cytobuoy b.v. (NL)），該設備(bei)設計用(yong)(yong)(yong)(yong)于(yu)研究0.8-800 μm之間的(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)個(ge)或群體浮(fu)游植物細(xi)胞(bao)。Cytosens分析了(le)來自連續流(liu)(liu)通系統的(de)(de)(de)(de)(de)海水，該系統以3米深(shen)處(chu)抽取，流(liu)(liu)速為1dm3/min，將(jiang)樣品導(dao)入中(zhong)間的(de)(de)(de)(de)(de)300cm3容器進行(xing)隔離(li)并盡量減(jian)少分析涵蓋的(de)(de)(de)(de)(de)體積。使(shi)(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)重量校準(zhun)的(de)(de)(de)(de)(de)蠕動泵將(jiang)樣品流(liu)(liu)速設置為5 mm3/s，導(dao)入鞘液循環（經過(guo)0.2 μm過(guo)濾的(de)(de)(de)(de)(de)NaCl溶液（35‰）），細(xi)胞(bao)在流(liu)(liu)動軸(zhou)方向(xiang)被分離(li)和(he)排列(lie)，然后被激光(guang)束（OBIS Coherent，488 nm，120 mW）檢測。使(shi)(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)兩(liang)個(ge)0.1 μm過(guo)濾器的(de)(de)(de)(de)(de)組(zu)合(he)不斷回收鞘液。前向(xiang)光(guang)散射(she)（FWS）被收集到兩(liang)個(ge)左右光(guang)電二極管上(shang)，并用(yong)(yong)(yong)(yong)于(yu)激光(guang)對準(zhun)控制。側向(xiang)光(guang)散射(she)（SWS）和(he)熒(ying)光(guang)發射(she)通過(guo)一組(zu)光(guang)學(xue)濾波器（SWS（488 nm），黃色(se)熒(ying)光(guang)（FLY，506–601 nm），橙色(se)熒(ying)光(guang)（FLO，601–650 nm）和(he)紅色(se)熒(ying)光(guang)（FLR，> 650 nm））分離(li)并收集到光(guang)電倍增管上(shang)。每24-72小時(shi)使(shi)(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)直徑為3μm（Cyto-Cal?）和(he)10μm（Polybead?）的(de)(de)(de)(de)(de)熒(ying)光(guang)珠進行(xing)熒(ying)光(guang)和(he)大小的(de)(de)(de)(de)(de)校準(zhun)。硅膠珠（Bangs lab?，二氧(yang)化硅微球），直徑為1.0、2.02和(he)3.13μm，用(yong)(yong)(yong)(yong)于(yu)估算浮(fu)游植物細(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)大小。2. 根據(ju)其(qi)光(guang)散射和(he)熒光(guang)特性對浮游植物(wu)群進行了(le)光(guang)學分(fen)(fen)(fen)辨(bian)。對于每(mei)個(ge)樣(yang)品(pin)，記錄了(le)兩(liang)次(ci)連續(xu)的(de)分(fen)(fen)(fen)析，分(fen)(fen)(fen)別設置(zhi)兩(liang)個(ge)不同(tong)(tong)的(de)FLR信號（10和(he)20 mV）觸發，以優化(hua)低葉綠素(su)含量(liang)和(he)高(gao)葉綠素(su)含量(liang)細胞的(de)分(fen)(fen)(fen)析。浮游植物(wu)群落使用Cytoclus?軟件進行分(fen)(fen)(fen)類(lei)。因此，每(mei)個(ge)細胞都通(tong)過一組光(guang)學脈沖形狀進行表征，這構成了(le)細胞學特征。使用不同(tong)(tong)尺寸(cun)的(de)微(wei)球珠區(qu)分(fen)(fen)(fen)了(le)藍藻（光(guang)合原核生物(wu)）、微(wei)微(wei)型真核藻（picoeukaryotes）、微(wei)型浮游植物(wu)和(he)小型浮游植物(wu)。3. 異養原核生物的豐度分析：每隔3小時，將1.8 cm3海水亞樣品立即用0.2 cm3 20％的多聚甲醛（PFA）溶液固定，使用死亡移液管（Vives-Rego等人，2000年），并放置在4°C的黑暗中15分鐘，然后在液氮-80°C存儲在，直到使用CyFlow space Partec流式細胞術進行流式細胞術分析，方法見Khammeri等人（2020年）。
4. 對于picoeukaryotes和 nanoeukaryotes，根據不同尺寸的的微球進行預測量，與其等效的細胞學前向散射特征（FWS）之間的校準關系，估算細胞生物體積。對于凱倫藻等細胞，細胞大小是通過儀器中的流動成像模塊生成的圖像確定的。使用Cytoclus 4軟件進行細胞大小測量。使用此方法處理了超過200個圖像。然后建立了細胞生物體積與前向散射特征（FWS）之間的關系。對每個群體分配一個系數，將生物體積轉換為碳生物量。例如凱倫藻（Lessard，1991年）和藍細菌Synechococcus（Mackey等人，2002年）的系數分別為0.14 pg C/μm和200 fg C/cell。Picoeukaryotes 和 nanoeukaryotes碳生物量使用Verity等人（1992年）的方程計算：
Qc, cal = aV0.866
Qc, cal：估算的每個細胞的平均碳生物量(fg C/cell)，V：生物體積 (μm3)，“a”值不同物種不同,分別為: Synechococcus=0.39, picoeukaryotes=0.32, nanoeukaryotes=0.27, cryptophytes=0.25。
最(zui)(zui)小和最(zui)(zui)大平(ping)均細胞生物體積(ji)之間的比率(lv)已用于估(gu)計每日生長(chang)速率(lv) (Binder等人，1996; Vaulot和Marie，1999)。這種方法假設，對于給(gei)定的群(qun)落，生長(chang)和分裂(lie)階(jie)段(duan)是同步的：
μratio = Log(Vmax / Vmin)
其中μratio是每日生長率（d-1），Vmax和Vmin分別是最大和最小的平均細胞生物體積（μm3/cell）。
表觀碳生物量的增加，定義為凈初級生產力（NPP），單位為mgC m3 d-1，使用碳轉換因子Qc, cal與N（豐度）和指數生長率的數量積進行計算。
NPP=Qc, cal×[eμratio-1]×N
在取樣期間(jian)，溫度在27-30°C之間(jian)波動，最(zui)高值(zhi)出現在赤潮(chao)(chao)期的(de)(de)前五天(tian)，赤潮(chao)(chao)結束時下降了1.5°C（圖(tu)2A）。平均鹽度相對(dui)穩(wen)定(ding)，在39左右，但偶爾出現低(di)于38.5的(de)(de)數值(zhi)（圖(tu)2B）。pH值(zhi)從赤潮(chao)(chao)開始的(de)(de)7.85變化到結束時的(de)(de)8.52（圖(tu)2C）。赤(chi)潮(chao)期間，氮(dan)主要(yao)以銨的(de)(de)形式存在(zai)(zai)，其濃度在(zai)(zai)0.25-18.91 μM的(de)(de)范(fan)圍內變(bian)化（圖(tu)2D）。硝酸鹽和亞硝酸鹽的(de)(de)平均濃度在(zai)(zai)約2.17 μM左右(you)波動。它們在(zai)(zai)第(di)(di)(di)(di)三和第(di)(di)(di)(di)四天(tian)(tian)顯示出超(chao)過(guo)4 μM，并在(zai)(zai)第(di)(di)(di)(di)六天(tian)(tian)達到了最大(da)值(zhi)(zhi)9.5 μM。磷(lin)在(zai)(zai)赤(chi)潮(chao)初期（從第(di)(di)(di)(di)1天(tian)(tian)到第(di)(di)(di)(di)3天(tian)(tian)）相(xiang)對較低，然(ran)后(hou)逐漸增加，在(zai)(zai)赤(chi)潮(chao)結束時顯示出最高值(zhi)(zhi)（4 μM）。N：P比值(zhi)(zhi)通常在(zai)(zai)赤(chi)潮(chao)開始階段(duan)（從第(di)(di)(di)(di)1天(tian)(tian)到第(di)(di)(di)(di)5天(tian)(tian)）高于16，顯示出潛在(zai)(zai)的(de)(de)磷(lin)限(xian)制(zhi)，而在(zai)(zai)赤(chi)潮(chao)結束時（從第(di)(di)(di)(di)6天(tian)(tian)到第(di)(di)(di)(di)10天(tian)(tian)）低于16，表明可能存在(zai)(zai)氮(dan)限(xian)制(zhi)（圖(tu)4）。硅酸鹽平均波動在(zai)(zai)4 μM左右(you)，在(zai)(zai)赤(chi)潮(chao)期間相(xiang)對穩定，除了第(di)(di)(di)(di)4天(tian)(tian)記錄的(de)(de)單個高值(zhi)(zhi)（19 μM）。
2. 浮游植(zhi)物(wu)和異養原核生物(wu)群落組成(cheng)根據材料和方法部分描述的細胞光學特性，通過流式細胞儀解析了六個浮游植物功能群（圖3）。在FLR vs. FLY和FLY vs. FWS圖上，區分了三個富含藻紅蛋白的聚類，通過其高FLY（藻紅蛋白）進行區分。識別為Synechococcus的聚類6細胞，計算的大小估計為1.77 ± 0.05 μm。聚類3和聚類4的細胞的計算大小分別為3.32 ± 0.74和14.25 ± 2.09 μm，并分別識別為類隱藻和隱藻。Picoeukaryotes和 nanoeukaryotes細胞具有較高的FLR和低的FLY，計算的大小分別估計為2.11 ± 0.04和3.71 ± 0.22 μm。聚類1的細胞表現出最高的FLR，相對較低的FLY，計算的大小估計為31.2 ± 1.65 μm。對于聚類1收集的細胞圖片，首次將其識別為Karenia selliformis（圖3C）。通過16S rDNA V4序列的代謝條形碼和系統發育分析，進一步證實了這一結果。在赤潮期間收集的5個樣品中，真核生物群落的多樣性分析顯示出存在14個作為Karenia屬的ASV（補充表1）。Karenia selliformis_ASV1是在監測期間檢測到的最豐富的真核生物ASV，其相對豐度在赤潮期開始（第2天）和結束（第8天）之間變化，分別為45.20％至17.53％。其他Karenia ASVs的表示非常少，最大相對豐度<2％。屬于八個Kareniaceae物種的18S rDNA V4區序列的系統發育樹（圖3D）顯示，主導的K. selliformis_ASV1序列與K. selliformis CAW79（100％一致）聚類，從而確認了赤潮物種的識別為K. selliformis。在監測期間，Karenia selliformis的貢獻在聚類1中的減少也通過相機輸出圖像觀察到（檢查了200多塊板），顯示該物種在赤潮的前六天中占據了超過90％的微生物，而在赤潮結束時約為20％，并出現了其他微型浮游物種，如斜紋硅藻Pleurosigma sp.和一些纖毛蟲。K. selliformis的豐度在監測期間波動在103至27 × 103 cell/cm3之間（圖4）。在第一個監測日（2019年9月27日），Karenia selliformis的濃度在103至9 × 103個cell/cm3之間變化，這對應于赤潮的良好生長階段（圖4）。最高濃度記錄在第5個監測日（2019年10月1日），這對應于春潮期。在此日期之后，濃度急劇下降，最終在監測結束時達到約（103cell/cm3），對應于退潮期，此時潮汐振幅變化小于1米。濃度的晝夜變化顯示，在高潮時記錄到最大值，而在低潮時記錄到最小值，證明了潮汐對赤潮的控制（圖4）。
Synechococcus和微型真核生物是最多的超微浮游植物群（見圖5），平均濃度約為104和2 × 103cell/cm3。它們在第一個監測日展示了最高的濃度。Synechococcus的濃度在赤潮結束時急劇下降至< 102cell/cm3。類隱藻的濃度約為102cell/cm3，在赤潮結束時保持了穩定的濃度，而更大的隱藻在赤潮結束時減少。異養原核生物的濃度平均波動在2 × 106cell/cm3左右，并沒有特定的變化趨勢。Karenia selliformis聚類在系統中占據了超過90%的碳生物量（見圖6），在第6天后，對碳生物量的貢獻減少到不到80%，而納米真核生物和隱藻的貢獻增加了（見圖6）。
3. Karenia selliformis的生長率和凈初級生產力Karenia selliformis細胞平均大小的晝夜變化顯示出相當同步的分布，這意味著細胞的生長和分裂在時間上是分開的。大小變化呈現出明顯的晝夜變化模式（見圖7），與文獻描述相符（Weiler和Chisholm，1976）。細胞生長始于黎明（大約上午5點），記錄到的最小細胞大小約為28 μm，而細胞分裂主要發生在夜間（大約晚上7點），最大細胞大小約為33 μm。尺寸譜的分析（見圖7）顯示，群落在赤潮爆發期的指數階段顯示出同步分布，而在赤潮結束時非同步分布，可能是由于群落的多種構成導致較大尺寸物種的出現（見圖8B）。
計算的生長速率在赤潮期的前幾天顯示出一般上升的趨勢（見圖8C），在第6天達到最大值，為0.76/d，相當于每天超過1次分裂。在赤潮衰減期間，生長速率約為0.6/d。凈初級生產力（NPP）在赤潮增長階段顯示出下降趨勢，第6天達到約14 mg C/m3/day的最大值，然后在赤潮結束時迅速下降至小于0.5 mg C/m3/day（第9天）。
1. 建立(li)長期(qi)監(jian)測(ce)將(jiang)對(dui)赤潮爆發(fa)、生長和(he)崩(beng)潰的(de)條件提供非常有用的(de)信(xin)息。如果監(jian)測(ce)站點是復(fu)發(fa)性HAB的(de)熱(re)點地(di)區，例如被認為加貝斯灣赤潮熱(re)點的(de)半封閉的(de)Boughrara瀉湖（Feki-Sahnoun等(deng)，2017年；Feki-Sahnoun等(deng)，2020年），那么建立(li)高頻率監(jian)測(ce)可能會更(geng)加有效(xiao)。2. 在大尺度（每周取樣）上調查的赤潮與環境變量（溫度和鹽度）之間的關系可能更多地表現為相關性而不是因果關系，而在更短時間尺度（1小時）上進行高分辨率觀察可能更能凸顯環境變量和Karenia selliformis赤潮之間的因果關系。3. 在物種組成方面，Karenia selliformis的暴發在生長期和穩定期的最初幾天幾乎是單一物種，但在暴發衰退期間則趨于多樣化。自動圖像分類機制在提供微型浮游植物組成中各物種相對貢獻的準確估計方面會更加有用（Campbell等人，2010）。Feki-Sahnoun等人（2020）使用樸素貝葉斯分類器模型框架分析了Karenia selliformis暴發期間和之后的物種組成，得出了不同的結論，顯示Karenia selliformis在暴發期間與一些裸藻和甲藻相關。這種差異可能源于所涉及調查的時間尺度不同。在每周監測中被認為是暴發的現象在高頻率調查中可能對應于暴發結束，因此可能反映出類似的多種物種組成，而暴發在其開始時是單一物種的。4. Karenia selliformis的生長速率和產量對生物量積累的影響。Karenia selliformis像大多數甲藻一樣，復制非常緩慢，每天的分裂少于1次（Brand等，2012）。在暴發期間測得的生長速率證實了這一說法，在暴發生長期和穩定期內，每天的分裂次數幾乎不到一次（<0.69 d?1），第6天的分裂次數超過一次，暴發結束時接近每天一次分裂（圖8）。問題在于Karenia selliformis如何在相對較低的生長速率下實現這種生物量積累。有人可能會質疑基于最大和最小平均生物體積比率的生長速率估計。這種簡單的方法假設細胞的生長和分裂是分時進行的（同步群體），而實際上這些過程在群體中是同時發生的（Waterbury等，1986；Binder和Chisholm，1995；Jacquet等，2001）。使用Sosik等人（2003）描述的大小結構化種群模型對整個整合期內的細胞生長和分裂進行建模，更能代表非同步群體（Dugenne等，2014；Marrec等，2018），并導致高于中位數尺寸比率的生長速率估計μratio = ln(vmax/vmin)（Marrec等，2018）。在最大生物量期內，由于尺寸譜的分解（圖7），生長速率估計受這種限制的影響較小，顯示出在暴發高峰期的分布相當緊湊，這主要受光/暗周期的控制（Ralston等，2007），而在暴發結束時尺寸分布更為分散（圖7）。基于流式細胞(bao)術結合圖像(xiang)處理(li)的浮(fu)游植物細胞(bao)尺寸的晝夜(ye)變化代表了一種(zhong)有(you)趣的技術，用于在(zai)高(gao)頻調查(cha)期(qi)間計算(suan)自然浮(fu)游植物群體的生長(chang)速率。此外，利用這種(zhong)技術監(jian)測有(you)害藻華非(fei)常有(you)用，因(yin)為(wei)它可以識別赤潮物種(zhong)及其在(zai)種(zhong)群和內在(zai)水平上的動態。研究指出，Karenia selliformis的豐度與營養成分之間存在高度相關性，暴發生長期可能受到磷（P）的限制，暴發結束時則可能受到氮（N）的限制。由于生態系統中特別富含有機物質和異養原核生物，Karenia selliformis的混合營養行為也不能被排除。在監測的最初幾天，Karenia selliformis幾乎表現為單一物種的暴發。計算的生長速率總體顯示較低值（<1次分裂/天），因此不足以解釋積累的生物量。潮汐動態似乎在爆發濃度中起到了主要作用。確定物理運輸和凈生長對某一地區物種積累的貢獻是值得研究的。Boudriga I, Abdennadher M, Khammeri Y, et al. . Harmful Algae, 2023, 121: 102366.如您需要了解更多信息，請識別下方二維碼填寫登記表，我們會為您提供專業的服務，真誠期待與您的合作！
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