近年來(lai)，CRISPR/Cas9技術在作物研究中(zhong)(zhong)取得了重(zhong)要進展(zhan)。然而(er)，由于(yu)(yu)農業重(zhong)要性(xing)狀大多是定(ding)量性(xing)狀，因(yin)(yin)此編(bian)(bian)輯啟動(dong)子(zi)以調控基因(yin)(yin)表(biao)(biao)達強度變(bian)得十分重(zhong)要。真核生(sheng)物啟動(dong)子(zi)由核心(xin)啟動(dong)子(zi)區域(yu)和(he)上游(you)順式(shi)調控元(yuan)件（CREs）組成。通(tong)(tong)過靶向(xiang)多個CREs來(lai)實現(xian)基因(yin)(yin)表(biao)(biao)達的改變(bian)通(tong)(tong)常(chang)是耗時的。相反，核心(xin)啟動(dong)子(zi)區域(yu)中(zhong)(zhong)的突變(bian)卻可以引(yin)起下游(you)基因(yin)(yin)轉錄本的豐度顯著變(bian)化。然而(er)，但受限于(yu)(yu)序列特征，常(chang)用(yong)的CRISPR系統通(tong)(tong)常(chang)難以用(yong)于(yu)(yu)核心(xin)啟動(dong)子(zi)編(bian)(bian)輯。最近發現的FrCas9與TATA PAM兼容，特(te)別是(shi)與核心啟動子TATA盒序列兼容。然而(er)，FrCas9的活性及其在(zai)植(zhi)物(wu)中的編輯模(mo)式(shi)尚未確定。
近期，安徽(hui)省(sheng)農業(ye)科學院水稻研(yan)究所李娟與安徽(hui)農業(ye)大(da)學魏鵬(peng)程(cheng)團隊在aBIOTECH發表了題為“Developing a CRISPR/FrCas9 system for core promoter editing in rice”的研究論文。研究團隊設(she)計了一種獨特的FrCas9系(xi)統，并(bing)利用該系(xi)統在水稻中(zhong)進行基因編輯，展示(shi)了其(qi)編輯植(zhi)物核心啟動子(zi)區域的潛力。
為(wei)(wei)了驗證(zheng)FrCas9系統的核心啟動子編輯(ji)能力，作(zuo)(zuo)者(zhe)使用TATA盒序列(lie)作(zuo)(zuo)為(wei)(wei)PAM，在Nipp（Oryza sativa L.cv Nipponbare）對白(bai)葉(xie)枯病菌（Xoo）易感基因OsSWEET13的近端啟動子上設計sgRNA。此外，為了直接監測編輯活性，設計了一個sgRNA以靶向水稻PDS基因。在48個PDS轉基因植株中，獲得了六個白化植株，表明FrCas9系統在水稻中具有活性。
為了評估FrCas9系統編輯TA豐富序列時的潛力以及在水稻中的編輯表現，作者在水稻PDS基因位點上設計了16個包含所有可能的5'-NNTA-3' PAM的sgRNA，通過對穩定轉化水稻愈傷組織的高通量測序表明，FrCas9系統編輯效率范圍從1.1%到35.3%，表明FrCas9的高PAM兼容性。FrCas9系統在TGTA、TATA和AGTA PAM位點編輯效率較高，分別達到35.3%、33.8%和32.1%，這與NNTA PAM的第二個核苷酸偏好為R（A/G）的假設一致。
為了進一步測試FrCas9的核心啟動子編輯能力，作者設計了一個帶有TGTA PAM的sgRNA，靶向水稻Waxy（WX）基因啟動子中非典型TATA（TACAAAT）序列。利用FrCas9編輯獲得了WXiA和WXiT純合編輯植株，純合/雙等位突變效率為50%。突變植株中WX表達量顯著下調，導致了直鏈淀粉含量（AC）顯著下降。同時，作者使用TATA為PAM的兩個相向靶點，實現了FrCas9介導的雙向編輯，在核心啟動子區產生多重突變和小片段精確缺失。此外，構建了源自FrCas9的堿基編輯器A3A-FrBE3和FrABE8e，并在T0轉基因植株中的評估其性能，結果顯示其具有較高編輯高精度。
該研究(jiu)在植物中建立了FrCas9介導的(de)(de)基(ji)(ji)因敲除和堿基(ji)(ji)編輯系統，并實現功能基(ji)(ji)因核心啟動子的(de)(de)高效編輯，為基(ji)(ji)因表達的(de)(de)微調和新種質(zhi)的(de)(de)創制提供了技術支(zhi)撐。
Wang H, Ding J, Zhu J, et al, et al. . aBIOTECH, 2024: 1-7.
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