室溫(wen)下(xia)活(huo)體葉綠素(su)熒光及光誘導的熒光變化(hua)由光系統II中激發的峰值在685 nm左右(you)的葉綠素(su)a熒光主導。光系統I熒光，F（I），峰值約730 nm，到目前為止被(bei)認為在活(huo)體中是恒(heng)定的。在這里，我們提出證據表明在綠色單細胞藻類小球藻、藍藻聚球藻和淡綠色常春藤葉片中，F（I）對可變熒光有顯著貢獻。本研究用多激發波長調制葉綠素熒光儀Multi-Color-PAM測量了440 nm強光在小球藻稀懸液中誘導的多相熒光上升（O-I1-I2-P），檢測波長分別在700 nm以上（F>700）和710 nm以下（F<710）。通過對(dui)F>700和F<710記錄的(de)(de)(de)10條曲線取平(ping)均值，即使是(shi)很小的(de)(de)(de)差異也能得到可(ke)靠的(de)(de)(de)評估。對(dui)構成特(te)定(ding)F（II）響(xiang)應(ying)的(de)(de)(de)O-I1相振幅進(jin)行(xing)標(biao)(biao)準化(hua)后(hou)，兩(liang)次(ci)記錄的(de)(de)(de)O-I1-I2相接近相同，但F>700的(de)(de)(de)I2-P相為F<710的(de)(de)(de)1.42倍(bei)。用625 nm強光化(hua)光在暗狀態(tai)2下對(dui)聚球藻進(jin)行(xing)的(de)(de)(de)類(lei)(lei)似測量中(zhong)(zhong)，在O-I1標(biao)(biao)準化(hua)后(hou)，F>700的(de)(de)(de)I2-P相甚至超過F<710的(de)(de)(de)I2-P相1.99倍(bei)。在對(dui)小球藻的(de)(de)(de)測量中(zhong)(zhong)，中(zhong)(zhong)等(deng)光化(hua)背(bei)景(jing)光和質(zhi)體醌拮抗劑(ji)DBMIB抑(yi)制了其I2-P相及(ji)PSI表(biao)觀可(ke)變熒光Fv（I）。對(dui)葉(xie)片(pian)(pian)的(de)(de)(de)類(lei)(lei)似測量由于不可(ke)避免的(de)(de)(de)光強梯度及(ji)由此產(chan)生的(de)(de)(de)F>700和F<710的(de)(de)(de)異質(zhi)來(lai)源而變得難以確定(ding)。但是(shi)一片(pian)(pian)淡綠色的(de)(de)(de)常(chang)春藤幼葉(xie)定(ding)性地(di)與懸(xuan)浮(fu)液的(de)(de)(de)結果相似，因此強烈地(di)暗示(shi)葉(xie)片(pian)(pian)中(zhong)(zhong)也存在Fv（I）。
本研(yan)究是德國WALZ首(shou)席科學家(jia)，PAM熒(ying)光儀發(fa)明人，德國伍(wu)茲(zi)堡大學教(jiao)授Ulrich Schreiber使用多激發(fa)波(bo)長調制(zhi)葉綠素熒(ying)光儀Multi-Color-PAM做(zuo)出的。該設備在具(ju)備極高靈敏度的同時又具(ju)有(you)很高的時間分(fen)辨率，非常適合于(yu)研(yan)究不同光(guang)質的強光(guang)誘導下葉綠素熒光(guang)快(kuai)速細微的變化過(guo)程。文章發表在2021年1月(yue)的Photosynthesis Research上。
圖1 用于測量F>700（1 mm RG9+2 mm低熒光RG665）和F<710（短通710 nm+2 mm低熒光RG665）的探測器濾光片組的透射光譜
圖2 使用Multi-Color-PAM在F>700(紅色)和F<710(藍色)測得的小球藻多相熒光上升曲線的比較。440 nm脈沖調制測量光和440 nm光化光（4018 μmol m?2 s?1）。葉綠素含量200 μg L-1。每隔5分鐘交替測量10次F>700和F<710曲線的平均值。弱遠紅光背景（1 μmol m?2 s?1 730 nm），用于誘導PS II供體和受體側狀態的標準參考條件，并考慮長期再現性。圖為PamWin-3軟件快速動力學窗口的原始截圖。
圖3 對F>700響應進行重縮放后，F>700(紅色)和F<710(藍色)信號的比較，以給出與F<710響應中相同的O-I1相位振幅。根據圖2所示的原始數據得出。使用4018 μmol m?2 s?1 440 nm。I1平臺在1 ms時到達(綠色垂直折線)。黑色垂直虛線放置在40 ms處，以標記I2-P階段的開始。使用Schreiber（1986）的原始命名法表示特征熒光水平O=Fo、I1、I2和P=Fm。a對數時間刻度。b線性時間刻度
圖4 標準化O-I1 Fv>700和Fv<710曲線的比較。通過減去各自Fo值從圖3中的數據導出
圖5 根據圖4所示的標準化O-I1 Fv>700和Fv<710曲線之間的差異得出的可變PS I熒光Fv（I）的動力學。坐標縮放如圖3所示。a組，線性時間刻度。b組，對數時間刻度
圖6 用96 μmol m?2 s?1 440 nm在恒定照光狀態下測量的多相熒光上升曲線導出的標準化O-I1 Fv>700和Fv<710曲線的比較。除背景照明外，使用相同的樣品進行與圖4的實驗相同的條件。F>700和F<710記錄各取10個平均值。比例與圖4相同。使用4018 μmol m?2 s?1 440 nm
圖7 在1 μM DBMIB存在下測量的多相熒光上升曲線得出的標準化O-I1 Fv>700和Fv<710曲線的比較。另外，與圖4的實驗條件相同，用與圖4和圖6的測量樣品相同。在弱遠紅光背景下，連續光照終止后2 h，在DBMIB存在下開始測量。縮放比例與圖4和6相同。應用4018 μmolm?2 s?1 440 nm
圖8 將標準化O-I1的F>700響應(紅色)反褶積為小球藻中的F（I）(黑色)和F（II）(綠色)分量。在假設I2-P完全由Fv（I）引起的情況下，通過標準化I2-P對F（I）進行重標度。F（II）(綠色)由標準化O-I1 F>700(紅色)減去標準化I2-P F（I）(黑色)得到。表明了Fo（I）和Fo（II）貢獻的振幅
圖9 根據在>700 nm和<710 nm處測量的強光照開始時誘導的多相熒光上升曲線的平行記錄，在暗色素狀態2下，聚球藻中Fv（I）的定量。激發：脈沖調制440 nm ML。光化光：4229 m?2 s?1 625 nm加891 μmol m?2 s?1 440 nm（高頻脈沖調制ML）。每條曲線是4次記錄的平均值，每5分鐘交替測量一次F>700和F<710。a對F>700響應重新縮放后的F>700(紅色)和F<710(藍色)信號進行比較，得出與F<710響應相同的O-I1相振幅。b O-I1平衡Fv>700和Fv<710反應的比較。顯示了特征熒光水平。
圖10 將標準化O-I1的F>700響應(紅色)反褶積為黑暗狀態2下的聚球藻的F（I）(黑色)和F（II）(綠色)分量。在假設I2-P完全由Fv（I）引起的情況下，對F（I）進行重定標。F（II）(綠色)由標準化O-I1的F>700(紅色)減去標準化I2-P的F（I）(黑色)得到。顯示了Fo（I）和Fo（II）貢獻的振幅
圖11 從淺綠色常春藤幼葉表面測量的F>700(紅色)和F<710(藍色)光誘導變化的比較。在1 ms下應用單周轉飽和閃光以誘導QA最大還原。重新縮放F>700響應，以獲得與F<710響應相同的O-I1相位振幅。入射光強度：7800 μmol m?2 s?1 440 nm。a O-I1平衡可變熒光產額的比較。b初步反褶積F（I）(黑色)和F（II）(綠色)對整個Fv>700響應(紅色)的貢獻，遵循與圖8和10中應用的相同程序，分別為小球藻和聚球藻。
本(ben)研(yan)究結(jie)果為活體(ti)內存在可變PS I熒光Fv（I）提供了有力證據，正如Lazar（2013）在(zai)(zai)生物(wu)信(xin)息(xi)學(xue)模(mo)擬基礎上提(ti)出(chu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)假設。這一證據是通過對(dui)綠藻(zao)(zao)和(he)(he)(he)藍藻(zao)(zao)稀懸(xuan)浮液中(zhong)強光(guang)誘導的(de)(de)(de)(de)(de)(de)長波和(he)(he)(he)短波發(fa)(fa)射帶（F>700和(he)(he)(he)F<710）熒光(guang)產(chan)額變化(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)對(dui)簡單(dan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)比(bi)較測量(liang)獲得的(de)(de)(de)(de)(de)(de)。F>700和(he)(he)(he)F<710的(de)(de)(de)(de)(de)(de)多相(xiang)上升(sheng)動力學(xue)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)定量(liang)比(bi)較依賴于(yu)一個公認(ren)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)概(gai)念，即初始O-I1上升(sheng)相(xiang)反(fan)映了PS-II反(fan)應(ying)中(zhong)心的(de)(de)(de)(de)(de)(de)關(guan)閉，因(yin)此可以(yi)(yi)認(ren)為(wei)是一種特殊的(de)(de)(de)(de)(de)(de)F（II）反(fan)應(ying)。在(zai)(zai)標準化(hua)F>700和(he)(he)(he)F<710響應(ying)中(zhong)O-I1相(xiang)位的(de)(de)(de)(de)(de)(de)振幅后，兩個信(xin)號中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)所有(you)F（II）分量(liang)應(ying)相(xiang)等，而任何(he)F（I）應(ying)導致F>700大(da)于(yu)F<710信(xin)號。這對(dui)Fo和(he)(he)(he)Fv都是適用的(de)(de)(de)(de)(de)(de)。我們(men)發(fa)(fa)現，不僅Fo>700大(da)于(yu)Fo<710，而且Fv>700大(da)于(yu)F<710。小球(qiu)藻(zao)(zao)和(he)(he)(he)聚球(qiu)藻(zao)(zao)在(zai)(zai)I2水平上表現出(chu)相(xiang)同的(de)(de)(de)(de)(de)(de)誘導動力學(xue)，但(dan)在(zai)(zai)F>700時，隨后的(de)(de)(de)(de)(de)(de)I2-P相(xiang)振幅明(ming)顯增大(da)。這一發(fa)(fa)現得出(chu)了I2-P含有(you)Fv（I）的(de)(de)(de)(de)(de)(de)結論(lun)，小球(qiu)藻(zao)(zao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)光(guang)誘導變化(hua)如圖5所示。這些結果令人印象深刻(ke)地支(zhi)持了Lazar（2013）關(guan)于(yu)Fv（I）預測振幅和(he)(he)(he)動力學(xue)性質的(de)(de)(de)(de)(de)(de)生物(wu)信(xin)息(xi)學(xue)理論(lun)預測。因(yin)此，Dusan Lazar的(de)(de)(de)(de)(de)(de)模(mo)擬和(he)(he)(he)我們(men)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)實驗證據可以(yi)(yi)被認(ren)為(wei)是互(hu)(hu)補的(de)(de)(de)(de)(de)(de)，相(xiang)互(hu)(hu)支(zhi)持的(de)(de)(de)(de)(de)(de)。
Dusan Lazar和我們(men)的(de)結論是基于一個(ge)普遍接受的(de)假設，即綠色植物和藻類的熒光發射源于色素系統II或色素系統I，后者的發射在波長>700 nm時更為明顯。當(dang)這一(yi)假設被接受時，很難(nan)找到(dao)合理的(de)(de)(de)(de)(de)替代(dai)理論來解釋歸一(yi)化(hua)O-I1的(de)(de)(de)(de)(de)F>700曲線(xian)中(zhong)I2-P相(xiang)的(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)對(dui)差異，而(er)非接近等于(yu)F<710曲線(xian)。然而(er)，由于(yu)PSⅠ受體的(de)(de)(de)(de)(de)耗(hao)盡（在Dusan-Lazar的(de)(de)(de)(de)(de)模(mo)擬中(zhong)誘導Fv（I））以及PSⅡ熒(ying)光(guang)(guang)(guang)的(de)(de)(de)(de)(de)增加，不能(neng)(neng)(neng)完(wan)全(quan)排除這種(zhong)可能(neng)(neng)(neng)性，應(ying)該通過仔(zi)細的(de)(de)(de)(de)(de)未來實驗(yan)進行研究確證(zheng)。PS-II熒(ying)光(guang)(guang)(guang)的(de)(de)(de)(de)(de)這種(zhong)增加不一(yi)定(ding)是(shi)由于(yu)PS-II反應(ying)中(zhong)心的(de)(de)(de)(de)(de)光(guang)(guang)(guang)化(hua)學猝(cu)(cu)(cu)滅的(de)(de)(de)(de)(de)抑制引起的(de)(de)(de)(de)(de)，可能(neng)(neng)(neng)是(shi)由于(yu)某種(zhong)形式的(de)(de)(de)(de)(de)非光(guang)(guang)(guang)化(hua)學猝(cu)(cu)(cu)滅的(de)(de)(de)(de)(de)抑制引起的(de)(de)(de)(de)(de)，必須闡(chan)明(ming)其(qi)(qi)特性。推測這種(zhong)猝(cu)(cu)(cu)滅的(de)(de)(de)(de)(de)候(hou)選物可能(neng)(neng)(neng)是(shi)氧化(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)PQ（Vernotte等，1979年）或具有相(xiang)對(dui)低效供(gong)體側(ce)的(de)(de)(de)(de)(de)PS II的(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)部(bu)分，其(qi)(qi)中(zhong)氧化(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)酪氨(an)酸(suan)Z和(he)P680+在強(qiang)光(guang)(guang)(guang)下(xia)積聚（Steffen等，2005年）。
Chukhutsina等（2019年(nian)）采用(yong)了一(yi)種(zhong)特(te)殊方法(fa)(fa)，在(zai)(zai)完整(zheng)的(de)(de)葉(xie)片上應用(yong)了高度復雜的(de)(de)時間(jian)分辨(bian)熒(ying)光(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)譜法(fa)(fa)，“避(bi)免了影(ying)響熒(ying)光(guang)(guang)(guang)衰減痕跡(ji)的(de)(de)任何可能(neng)的(de)(de)光(guang)(guang)(guang)學人工干(gan)擾”，特(te)別關注了PS I熒(ying)光(guang)(guang)(guang)的(de)(de)貢獻。但并未觀察到Fv（I）。在(zai)(zai)這種(zhong)情(qing)況下(xia)，重要(yao)的(de)(de)是要(yao)認(ren)識到Fv（I）是一(yi)種(zhong)瞬(shun)態現象，它會被預照(zhao)光(guang)(guang)(guang)抑(yi)制。在(zai)(zai)PSⅠ抑(yi)制劑存在(zai)(zai)下(xia)，最大PSⅠ熒(ying)光(guang)(guang)(guang)不能(neng)簡單地(di)由光(guang)(guang)(guang)照(zhao)誘(you)導，類似(si)于在(zai)(zai)DCMU存在(zai)(zai)下(xia)Fm（II）的(de)(de)誘(you)導。據我們所見，只有在(zai)(zai)使用(yong)可誘(you)導重復顯示(shi)明顯I2-P相的(de)(de)樣品進行(xing)測(ce)量的(de)(de)情(qing)況下(xia)，才有可能(neng)通(tong)過時間(jian)分辨(bian)熒(ying)光(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)譜法(fa)(fa)確認(ren)活體內Fv（I）的(de)(de)證據。在(zai)(zai)圖(tu)9和圖(tu)10的(de)(de)條件下(xia)對藍(lan)藻進行(xing)測(ce)量應該(gai)不是一(yi)個太難的(de)(de)任務(wu)。
Schreiber教授在(zai)文章引(yin)言(yan)中表示，對于像他和Christof Klughammer這(zhe)(zhe)樣的儀(yi)器(qi)開發(fa)者來說，沒有(you)什么(me)比看到有(you)能力(li)的研究人(ren)員對我們(men)的新設備(bei)進行最佳(jia)利用更值得的了。有(you)鑒于此，我們(men)衷心感謝澳大(da)利亞國立大(da)學(xue)Fred Chow用PAM儀(yi)器(qi)進行的所有(you)精彩實驗。我們(men)將這(zhe)(zhe)篇(pian)關于PS-I在(zai)體內的可變熒光的交流獻給他，希望我們(men)的發(fa)現能幫助(zhu)他發(fa)現更多(duo)復雜的光合(he)作用拼圖中的小(xiao)片段。也許現在(zai)一起(qi)尋(xun)找(zhao)還不晚。