雙單(dan)倍體(ti)（Doubled Haploid）育(yu)種(zhong)，簡稱DH育(yu)種(zhong)，是利(li)用誘導系(xi)誘導（或(huo)花藥離體(ti)培(pei)養等(deng)手段(duan)誘導）產(chan)生單(dan)倍體(ti)植(zhi)株(zhu)，再通過染色(se)體(ti)組加(jia)倍（自然(ran)加(jia)倍或(huo)藥劑處理）使植(zhi)物(wu)恢復(fu)正常(chang)染色(se)體(ti)數(shu)的育(yu)種(zhong)方法。DH育(yu)種(zhong)能夠(gou)在(zai)較短時(shi)間（2代(dai)）內便可以選育(yu)出DH純系(xi)，大大縮短育(yu)種(zhong)年限(xian)，是加(jia)速(su)種(zhong)質材料(liao)純化、縮短育(yu)種(zhong)年限(xian)的有效途徑，是現(xian)代(dai)生物(wu)技術(shu)育(yu)種(zhong)的主(zhu)要支柱技術(shu)之一。
由于自然單性生殖(zhi)或(huo)孤雄生殖(zhi)單倍(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)非常罕見，因(yin)此(ci)單倍(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)的(de)獲得(de)成為(wei)單倍(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)育(yu)種(zhong)的(de)一(yi)個(ge)難點(dian)，游(you)(you)離小(xiao)孢(bao)子(zi)(zi)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)是(shi)獲得(de)單倍(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)的(de)重要(yao)手段之一(yi)。植物(wu)游(you)(you)離小(xiao)孢(bao)子(zi)(zi)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)受外植體(ti)(ti)(ti)預(yu)處(chu)理、小(xiao)孢(bao)子(zi)(zi)預(yu)處(chu)理、供體(ti)(ti)(ti)基因(yin)型、小(xiao)孢(bao)子(zi)(zi)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)密度、培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)基pH值和培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)基成分等(deng)因(yin)素的(de)共(gong)同(tong)影響，因(yin)此(ci)無法形(xing)成通用的(de)誘(you)導(dao)策略，需要(yao)從花芽選取(qu)、小(xiao)孢(bao)子(zi)(zi)胚誘(you)導(dao)、二倍(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)化等(deng)各個(ge)環節進(jin)行不(bu)斷的(de)調整和改善，才能構(gou)建一(yi)種(zhong)植物(wu)優(you)選的(de)游(you)(you)離小(xiao)孢(bao)子(zi)(zi)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)體(ti)(ti)(ti)系。
本文利用Ampha Z32花粉活力分析儀（阻抗流式細胞技(ji)術，IFC）進行了系列測試，以期(qi)幫助(zhu)廣大(da)科研用戶構(gou)建優選的(de)(de)游離(li)小孢(bao)子培(pei)養體系，提高游離(li)小孢(bao)子的(de)(de)培(pei)養效率：1）確定小孢子各發育階段的相位角-振幅散點圖，并歸納發育變化軌跡；2）確定培養開始前和整個培養過程中小孢子的活力；3）估算小孢子的密度；4）監測小孢子對誘導策略和培養條件的響應，進行產胚率的早期預測。
—— 小孢子發育階段 ——
小(xiao)(xiao)孢(bao)子(zi)發育(yu)時(shi)期(qi)是(shi)影(ying)響(xiang)小(xiao)(xiao)孢(bao)子(zi)培(pei)養的(de)(de)關(guan)鍵(jian)因(yin)素之一，選擇合(he)適的(de)(de)花粉發育(yu)時(shi)期(qi)可(ke)極大(da)的(de)(de)提高(gao)植株小(xiao)(xiao)孢(bao)子(zi)胚(pei)狀體發生的(de)(de)誘導(dao)效率。大(da)量(liang)研究表明(ming)，通(tong)常(chang)小(xiao)(xiao)孢(bao)子(zi)培(pei)養的(de)(de)最(zui)佳時(shi)期(qi)是(shi)單核(he)晚期(qi)（單核(he)靠邊期(qi)）和(he)雙核(he)早(zao)期(qi)，這可(ke)能是(shi)由于單核(he)靠邊期(qi)的(de)(de)小(xiao)(xiao)孢(bao)子(zi)處于面臨不同分裂(lie)方式和(he)發育(yu)途徑的(de)(de)敏感時(shi)期(qi)，更容易(yi)誘導(dao)成功。因(yin)此，準確判斷并(bing)選擇最(zui)適時(shi)期(qi)的(de)(de)小(xiao)(xiao)孢(bao)子(zi)進(jin)行(xing)培(pei)養，是(shi)提高(gao)產胚(pei)量(liang)的(de)(de)基本保障(zhang)。
傳統(tong)上(shang)進行小孢(bao)子(zi)發(fa)育(yu)階段的(de)(de)鑒(jian)定是通過染(ran)(ran)色鏡(jing)檢法，即用DAPI或乙酰胭脂紅對(dui)采自不同(tong)大小花蕾或穗的(de)(de)小孢(bao)子(zi)進行染(ran)(ran)色，然后顯微鏡(jing)觀察細胞核(he)的(de)(de)數目和形(xing)態，并計數以確定各發(fa)育(yu)階段細胞所占的(de)(de)比例，此過程極其費時、耗力。
由于處于不(bu)同(tong)(tong)發育(yu)(yu)階段的(de)小孢子(zi)的(de)體積、細胞(bao)質和細胞(bao)膜的(de)特(te)性不(bu)同(tong)(tong)，Ampha Z32花粉(fen)活(huo)力分析(xi)儀所檢測到的(de)電(dian)阻抗信(xin)號也(ye)(ye)就不(bu)同(tong)(tong)，由此而生成(cheng)的(de)相位角（X-相對(dui)(dui)活(huo)性）-振幅（Y-相對(dui)(dui)大(da)小）散(san)點圖(tu)不(bu)同(tong)(tong)，所形成(cheng)的(de)散(san)點類(lei)群也(ye)(ye)不(bu)同(tong)(tong)。如圖(tu)1所示，小麥孢子(zi)發育(yu)(yu)過程散(san)點圖(tu)的(de)變(bian)化以(yi)及DAPI染色法確定的(de)對(dui)(dui)應發育(yu)(yu)階段。本測(ce)(ce)試使用(yong)AF6緩沖(chong)液從(cong)單個小(xiao)穗的(de)花(hua)藥中分離出(chu)小(xiao)孢子(zi)，取極小(xiao)的(de)一部分進(jin)行(xing)DAPI染色，剩余部分經過(guo)濾稀(xi)釋后用(yong)Ampha Z32花(hua)粉活力分析儀進(jin)行(xing)測(ce)(ce)量。
圖1 小麥孢子發育變化軌跡
我(wo)(wo)們測試了(le)多種(zhong)植(zhi)物在(zai)不同(tong)發(fa)育(yu)階段(duan)(duan)的(de)散(san)點(dian)云(yun)圖(tu)，并(bing)對(dui)比了(le)不同(tong)發(fa)育(yu)階段(duan)(duan)散(san)點(dian)云(yun)變化(hua)，結果表明(ming)(ming)通(tong)過(guo)散(san)點(dian)圖(tu)的(de)變化(hua)軌跡均(jun)可(ke)(ke)以(yi)準(zhun)(zhun)確區(qu)分出小(xiao)孢子的(de)不同(tong)發(fa)育(yu)階段(duan)(duan)。如圖(tu)2所(suo)示，不同(tong)發(fa)育(yu)階段(duan)(duan)的(de)散(san)點(dian)顏色不同(tong)，三細胞(bao)花(hua)(hua)(hua)粉(fen)物種(zhong)（西藍花(hua)(hua)(hua)、辣椒）成熟軌跡中(zhong)的(de)散(san)點(dian)類(lei)群(qun)(qun)明(ming)(ming)顯(xian)多于二細胞(bao)花(hua)(hua)(hua)粉(fen)物種(zhong)（水稻）。利(li)用Ampha Soft軟件的(de)統(tong)計(ji)分析功(gong)能，我(wo)(wo)們可(ke)(ke)以(yi)量化(hua)每個(ge)(ge)顏色類(lei)群(qun)(qun)的(de)散(san)點(dian)數(shu)，即統(tong)計(ji)出每個(ge)(ge)發(fa)育(yu)階段(duan)(duan)的(de)小(xiao)孢子的(de)數(shu)量及比例，幫助確定(ding)特定(ding)發(fa)育(yu)階段(duan)(duan)占比較高的(de)花(hua)(hua)(hua)芽(ya)的(de)大小(xiao)或小(xiao)穗所(suo)處的(de)位置，如圖(tu)3所(suo)示。小(xiao)孢子發(fa)育(yu)階段(duan)(duan)的(de)準(zhun)(zhun)確判定(ding)，為小(xiao)孢子供(gong)體(ti)的(de)選擇帶來極大的(de)便利(li)，可(ke)(ke)極大的(de)提高植(zhi)株小(xiao)孢子胚狀體(ti)發(fa)生的(de)誘(you)導頻率。
圖2 小孢子不同發育階段的散點云疊加圖
圖3 麥穗不同穗位的單核、雙核和三核小孢子的比例
盡管同(tong)一(yi)物種的花粉(fen)在發育的單核早期、單核晚期及(ji)成熟(shu)早期的相位角-振(zhen)(zhen)幅(fu)散點圖中具有相似的相位角，但振(zhen)(zhen)幅(fu)大小(xiao)(xiao)卻可(ke)能差異(yi)顯(xian)著，這是由于遺(yi)傳變異(yi)會影響小(xiao)(xiao)孢子的大小(xiao)(xiao)，因(yin)此(ci)我們建議根據基因(yin)型評估不同(tong)花粉(fen)的發育階段(duan)。
—— 小孢子的活力和密度 ——
小(xiao)孢(bao)子(zi)的(de)活力(li)(li)和密度亦是影響小(xiao)孢(bao)子(zi)胚狀體(ti)產生(sheng)的(de)主(zhu)要因素。本(ben)實驗利(li)(li)用(yong)(yong)Ampha Z32花(hua)粉活力(li)(li)分析儀對這兩個指標進行了(le)測試(shi)，同時利(li)(li)用(yong)(yong)FDA染色法(fa)測試(shi)細(xi)胞活力(li)(li)，利(li)(li)用(yong)(yong)血球(qiu)計數器進行細(xi)胞計數。
Ampha Z32花(hua)(hua)(hua)粉(fen)(fen)(fen)活(huo)力分(fen)析儀（Amphasys，瑞士），通過檢測流經交流電場的(de)(de)(de)花(hua)(hua)(hua)粉(fen)(fen)(fen)懸(xuan)浮液中花(hua)(hua)(hua)粉(fen)(fen)(fen)的(de)(de)(de)電阻抗信號，分(fen)析獲得花(hua)(hua)(hua)粉(fen)(fen)(fen)的(de)(de)(de)數(shu)量、大(da)小、活(huo)性(xing)，測量過程中確保懸(xuan)浮液介(jie)質電導率的(de)(de)(de)穩定(ding)對(dui)準確評估(gu)花(hua)(hua)(hua)粉(fen)(fen)(fen)活(huo)性(xing)是非常重要的(de)(de)(de)。大(da)量實驗表(biao)明，緩沖液（AmphaFluid）體積(ji)占比達到50-80%，才能較好的(de)(de)(de)評估(gu)小孢子的(de)(de)(de)活(huo)性(xing)，由(you)于不(bu)同培養(yang)介(jie)質的(de)(de)(de)電導率不(bu)同，建議通過多次(ci)實驗確定(ding)小孢子培養(yang)液和緩沖液（AmphaFluid）的(de)(de)(de)較優體積(ji)比。移(yi)取精確(que)(que)體積的(de)小孢(bao)子混合液(ye)后，在Ampha Z32花粉活(huo)力(li)分(fen)析(xi)儀(yi)的(de)計數模式下進行測量即(ji)可確(que)(que)定(ding)小孢(bao)子的(de)準(zhun)確(que)(que)濃度(du)，并(bing)統計出活(huo)性小孢(bao)子的(de)數量，整個(ge)測試過程不超過2min。
圖4 南瓜(gua)小(xiao)孢子散(san)點圖
—— 誘導成功率(lv)評(ping)估及產胚量的早期預測 ——
法國Vegenov研究所利用AmphaZ32花粉活力分析儀追蹤了小麥小孢子的發育過程（案例介紹：Ampha Z32在小麥孢子發育及產胚量(liang)早期預測中(zhong)的應用）。實驗結果(guo)顯示，經誘導處(chu)理后(hou)，大部分(fen)小(xiao)(xiao)(xiao)麥小(xiao)(xiao)(xiao)孢子在培養的幾天內就停止了(le)發(fa)育，只有(you)一小(xiao)(xiao)(xiao)部分(fen)活細胞能(neng)逐漸分(fen)裂成(cheng)(cheng)星(xing)形小(xiao)(xiao)(xiao)孢子，最后(hou)形成(cheng)(cheng)有(you)組織結構的胚狀體。
Vegenov的(de)(de)研究發現(xian)，IFC信(xin)號(hao)隨小(xiao)麥小(xiao)孢(bao)子(zi)(zi)(zi)形態、細(xi)(xi)(xi)胞大(da)小(xiao)的(de)(de)變化而變化，結合顯微鏡鏡檢（圖(tu)5），可(ke)以(yi)準確匹配到小(xiao)孢(bao)子(zi)(zi)(zi)發育的(de)(de)不同階段。從IFC信(xin)號(hao)所確定(ding)的(de)(de)相(xiang)位角(jiao)-振幅(fu)(fu)散點(dian)圖(tu)中(zhong)(zhong)可(ke)利用多邊形門控(kong)區分(fen)(fen)出處于不同發育狀(zhuang)(zhuang)態的(de)(de)小(xiao)孢(bao)子(zi)(zi)(zi)類(lei)群(qun)(qun)(qun)(qun)，如圖(tu)6所示(shi)。其中(zhong)(zhong)小(xiao)孢(bao)子(zi)(zi)(zi)經過(guo)脅迫處理(li)后(hou)(hou)（D0），相(xiang)位角(jiao)-振幅(fu)(fu)散點(dian)圖(tu)中(zhong)(zhong)出現(xian)的(de)(de)P2細(xi)(xi)(xi)胞類(lei)群(qun)(qun)(qun)(qun)為具有活性(xing)的(de)(de)小(xiao)孢(bao)子(zi)(zi)(zi)群(qun)(qun)(qun)(qun)，后(hou)(hou)續實(shi)驗(yan)證明(ming)(ming)，這一(yi)類(lei)群(qun)(qun)(qun)(qun)反映了小(xiao)麥小(xiao)孢(bao)子(zi)(zi)(zi)對(dui)誘導處理(li)的(de)(de)響應(ying)，可(ke)幫助在(zai)小(xiao)孢(bao)子(zi)(zi)(zi)培(pei)養(yang)前確定(ding)誘導處理(li)的(de)(de)效果，提(ti)高(gao)胚(pei)狀(zhuang)(zhuang)體發生的(de)(de)成功率(lv)。而培(pei)養(yang)開(kai)始后(hou)(hou)出現(xian)的(de)(de)P3細(xi)(xi)(xi)胞類(lei)群(qun)(qun)(qun)(qun)，與花(hua)粉(fen)發育（配子(zi)(zi)(zi)體發育途徑(jing)）過(guo)程中(zhong)(zhong)發現(xian)的(de)(de)任何細(xi)(xi)(xi)胞類(lei)群(qun)(qun)(qun)(qun)都(dou)不重疊，這表(biao)明(ming)(ming)該(gai)類(lei)群(qun)(qun)(qun)(qun)是孢(bao)子(zi)(zi)(zi)體發育途徑(jing)中(zhong)(zhong)特有的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞類(lei)群(qun)(qun)(qun)(qun)。培(pei)養(yang)過(guo)程中(zhong)(zhong)，該(gai)類(lei)群(qun)(qun)(qun)(qun)細(xi)(xi)(xi)胞數(shu)量(liang)逐漸(jian)減(jian)少，振幅(fu)(fu)和相(xiang)位逐漸(jian)增大(da)，說明(ming)(ming)部分(fen)(fen)小(xiao)孢(bao)子(zi)(zi)(zi)在(zai)這一(yi)過(guo)程中(zhong)(zhong)死亡，而部分(fen)(fen)小(xiao)孢(bao)子(zi)(zi)(zi)胚(pei)在(zai)不斷(duan)生長(chang)發育。此外(wai)，本實(shi)驗(yan)還(huan)以(yi)IFC測試數(shu)據為基礎，建立了預測胚(pei)胎產量(liang)的(de)(de)線性(xing)數(shu)學模型(xing)，統(tong)計(ji)分(fen)(fen)析表(biao)明(ming)(ming)，培(pei)養(yang)第7天P3類(lei)群(qun)(qun)(qun)(qun)的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞數(shu)量(liang)可(ke)以(yi)準確預測30d后(hou)(hou)的(de)(de)胚(pei)胎產量(liang)（y=6.539x-20.827；R^2=0.9519，p <0.05）。
圖5 Pavon小麥(mai)配子體(ti)和孢(bao)子體(ti)途徑的發育階(jie)段
（A）單核(he)小孢(bao)子(zi)(zi)(zi)；（B）雙核(he)小孢(bao)子(zi)(zi)(zi)；（C）花粉粒；（D）星(xing)形小孢(bao)子(zi)(zi)(zi)（v為液泡(pao)）；（E）多核(he)小孢(bao)子(zi)(zi)(zi)；（F）質膜(mo)化(hua)小孢(bao)子(zi)(zi)(zi)
圖6 Pavon小麥配子體(ti)和孢子體(ti)途徑的發育階段(duan)（IFC法）
配子(zi)體(ti)途(tu)徑(jing)(jing)：ML：單(dan)核中(zhong)晚(wan)期(qi)；EB：早期(qi)雙核；LB：單(dan)核晚(wan)期(qi)；ET：三(san)核早期(qi)；LT：三(san)核晚(wan)期(qi)。孢(bao)(bao)子(zi)體(ti)途(tu)徑(jing)(jing)：培(pei)(pei)養(yang)前21天、培(pei)(pei)養(yang)第0、1、5和(he)7天的小(xiao)孢(bao)(bao)子(zi)發(fa)育(yu)狀態(tai)。ML/D-21代表配子(zi)體(ti)發(fa)育(yu)和(he)孢(bao)(bao)子(zi)體(ti)發(fa)育(yu)的共(gong)同階(jie)段，紅色(se)垂直門(men)(men)控(kong)右(you)側為(wei)活性(xing)細胞，藍色(se)多邊(bian)形門(men)(men)控(kong)P1為(wei)雄核發(fa)育(yu)開始(shi)時的活性(xing)孢(bao)(bao)子(zi)群(qun)；綠色(se)多邊(bian)形門(men)(men)控(kong)P2為(wei)脅迫處(chu)理(li)后(hou)(hou)，孢(bao)(bao)子(zi)離體(ti)培(pei)(pei)養(yang)前（D0）的活性(xing)孢(bao)(bao)子(zi)群(qun)；紫色(se)多邊(bian)形門(men)(men)控(kong)P3為(wei)離體(ti)培(pei)(pei)養(yang)1天后(hou)(hou)的活性(xing)孢(bao)(bao)子(zi)群(qun)。
以上結果表明，IFC法可(ke)以在DH育種(zhong)過(guo)程中，幫助(zhu)選擇小(xiao)(xiao)孢(bao)子植物供體，評(ping)估小(xiao)(xiao)孢(bao)子胚誘導策略(lve)，優化培(pei)(pei)養(yang)條件，并(bing)在小(xiao)(xiao)孢(bao)子培(pei)(pei)養(yang)早期進行產胚量的(de)準確預測，可(ke)顯著提高游離小(xiao)(xiao)孢(bao)子培(pei)(pei)養(yang)的(de)成功率(lv)，進而加快DH育種(zhong)的(de)效率(lv)。
案例介(jie)紹視(shi)頻：，Password: #9w6Z6y&
原文(wen)閱讀：
相關閱讀：
? Ampha Z32花粉活力分析儀在高粱生殖耐寒性雜交優勢研究中的應用