Ampha Z32阻抗流(liu)式細(xi)胞儀(yi)（IFC）可在(zai)單細(xi)胞水平上快速表征大(da)量細(xi)胞活(huo)性(xing)狀(zhuang)態。測(ce)試全(quan)過程(cheng)無需(xu)使用(yong)任何標記物(wu)和染料，基于懸浮液中單細(xi)胞本(ben)身(shen)的電阻抗特性(xing)，實現對細(xi)胞活(huo)性(xing)的在(zai)線、高通量、快速、無損檢測(ce)。本(ben)實驗使用(yong)Ampha Z32阻抗流(liu)式細(xi)胞儀(yi)（IFC）測(ce)試了(le)不同培養狀(zhuang)態下(xia)BL2細(xi)胞（起源于Burkitt淋巴瘤）的活(huo)性(xing)和濃度(du)，并(bing)觀察了(le)細(xi)胞凋亡過程(cheng)的阻抗相位響應。
Ampha Z32阻(zu)抗流式細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)儀（IFC）核心部(bu)件是微(wei)流控芯片(pian)，當懸(xuan)浮的(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)被泵(beng)入微(wei)芯片(pian)后，在外加(jia)交(jiao)流電(dian)(dian)場(chang)(chang)作用下(xia)，不同(tong)活性狀態的(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)會(hui)產生(sheng)不同(tong)的(de)阻(zu)抗信號。細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)大(da)小、細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)膜活性（離子泵(beng)）、細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)內(nei)部(bu)特(te)(te)性（如液(ye)泡(pao)或脂質(zhi)外殼）都會(hui)影響(xiang)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)所產生(sheng)的(de)阻(zu)抗信號。在變化的(de)電(dian)(dian)場(chang)(chang)頻(pin)(pin)率(lv)下(xia)，儀器即可捕捉(zhuo)到細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)這(zhe)些特(te)(te)性，本儀器可以在0.3-30MHz范圍內(nei)的(de)電(dian)(dian)場(chang)(chang)頻(pin)(pin)率(lv)下(xia)同(tong)時檢測(ce)4個不同(tong)頻(pin)(pin)率(lv)下(xia)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)電(dian)(dian)阻(zu)抗特(te)(te)性，如低頻(pin)(pin)（0.1-0.5MHz）和中頻(pin)(pin)（0.5-5MHz）分別捕捉(zhuo)有關細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)體積和細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)膜性能的(de)信息，而(er)更(geng)高頻(pin)(pin)率(lv)（>5MHz）中則(ze)更(geng)傾向于探測(ce)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)內(nei)結構和細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)質(zhi)特(te)(te)性。
圖1 A）Ampha Z32阻抗(kang)流式細胞(bao)儀；B）微(wei)流控(kong)芯片
阻抗原(yuan)始信(xin)號(hao)由實(shi)部（電(dian)阻）和虛部（容性電(dian)抗）組(zu)成（圖(tu)(tu)2B），經信(xin)號(hao)分析(xi)后在AmphaSoft軟件中(zhong)以(yi)相位-振幅散點圖(tu)(tu)的(de)(de)形式輸出(chu)（圖(tu)(tu)3）。散點圖(tu)(tu)上每個(ge)數據點對應(ying)一個(ge)測細胞(bao)的(de)(de)阻抗響應(ying)。根據樣(yang)品細胞(bao)濃度的(de)(de)不同，每秒可(ke)以(yi)分析(xi)數百到上千個(ge)細胞(bao)。
圖2 BL2細胞的阻抗信號
A) 每(mei)秒的(de)原始(shi)信號。每(mei)個振幅對應于細胞(bao)通(tong)過微流控芯(xin)片(pian)電場時的(de)信號。B) 部(bu)分原始(shi)信號的(de)放大，顯示了兩個活細胞(bao)和一個死細胞(bao)的(de)阻抗(kang)響應。原始(shi)信號由實部(bu)（藍線）和虛(xu)部(bu)（綠線）組成。通(tong)過識別實部(bu)和虛(xu)部(bu)信號的(de)峰(feng)值，換算成每(mei)個細胞(bao)的(de)相位(wei)角和振幅。
AmphaSoft軟件可直觀的(de)輸出每個測試(shi)樣品(pin)的(de)相位-振幅散點圖，并進(jin)行活性(xing)-失活類群分析、不同(tong)樣品(pin)的(de)疊加分析以(yi)及選(xuan)定類群的(de)統計分析，并可以(yi).CSV，.HTML及.PNG格式(shi)輸出綜(zong)合報告(gao)和結果。此外，針對不同(tong)樣品(pin)的(de)測試(shi)模(mo)板(ban)方便用于(yu)同(tong)系列和同(tong)類型(xing)樣品(pin)的(de)重復測量和比較。
圖3 BL2的相位-振(zhen)幅散點圖
如圖3所示，在10 MHz測量頻率下，該培養狀態的BL2細胞的活性為83.37%。相位-振幅散點圖的頂部和右側分別顯示了相位直方圖和振幅直方圖。當使用多個頻率測量細胞時，AmphaSoft軟件可在同一個界面輸出每個頻率的測量結果，直觀對比細胞對不同頻率的阻抗響應。上圖散點圖中的左側類群對應于死細胞，而右側類群對應于活細胞。顏色差異顯示了細胞的密集程度。
Ampha Z32的測(ce)試流程
Ampha Z32測量過(guo)程無(wu)需(xu)對(dui)細胞進行染色標(biao)記(ji)，且(qie)樣品的使用量很小(xiao)。測量前只需(xu)經(jing)過(guo)稀釋、添加測量緩(huan)沖(chong)液和過(guo)濾三個步驟。
（一）從細胞培養(yang)液中(zhong)取樣，通常(chang)僅需50–100μl；
（二）根據細胞類型和(he)應用，選取(qu)合(he)適(shi)的測(ce)量緩沖液稀(xi)釋樣(yang)品；
對于BL2細胞而言，使用AF6測量緩沖液。通常，如果(guo)直接從培養液中提(ti)取樣品，則建議在1:1到(dao)1:10之間(jian)稀釋(shi)。
（三）過濾以去(qu)除顆粒團塊；此步驟(zou)取(qu)決于細胞培養物的大小(xiao)、純(chun)度以及(ji)顆粒與(yu)芯片通(tong)道橫截面的比率。
對于BL2細胞，不需要(yao)過濾步驟。
（四）上(shang)樣測量；測試過程全自動，并在達到某個設定停止條件（時間、細胞數量、體積）或用戶手動停止測量時結束。
不同培養時期BL2細胞的活力
活的(de)(de)和失(shi)活的(de)(de)BL2細胞(bao)(bao)的(de)(de)阻(zu)抗信號(hao)有明顯的(de)(de)差異（圖(tu)(tu)2B）。在(zai)相(xiang)位(wei)-振幅點圖(tu)(tu)中，兩(liang)者歸屬于(yu)不同(tong)的(de)(de)散點云類群(qun)。失(shi)活細胞(bao)(bao)在(zai)低阻(zu)抗相(xiang)位(wei)角(jiao)形成(cheng)一個(ge)封閉的(de)(de)云群(qun)，而活細胞(bao)(bao)通常在(zai)高阻(zu)抗相(xiang)位(wei)角(jiao)形成(cheng)一個(ge)分布(bu)更廣(guang)泛的(de)(de)云群(qun)。對處于(yu)不同(tong)培養時期的(de)(de)細胞(bao)(bao)，隨著細胞(bao)(bao)開始(shi)凋(diao)亡和死亡，活細胞(bao)(bao)云群(qun)的(de)(de)相(xiang)位(wei)角(jiao)逐漸(jian)減(jian)小。
圖4 不同培養時期BL2細胞的活力分析
圖5 不同培養時期BL2細胞的阻抗相位和細胞活力的變化
圖(tu)5顯示BL2細胞在培(pei)養的(de)0、1、2和6天內阻抗(kang)相位和細胞活(huo)(huo)力的(de)變(bian)化。從(cong)圖(tu)中可以(yi)看到，在第1天之后，BL2活(huo)(huo)細胞群發(fa)生明顯相移且細胞活(huo)(huo)力的(de)急(ji)劇下(xia)降。
BL2細(xi)胞濃(nong)度
除(chu)了(le)(le)細胞(bao)活(huo)力之外，Ampha Z32阻抗(kang)流式細胞(bao)儀還可(ke)準(zhun)確(que)測量BL2的(de)總細胞(bao)數、活(huo)細胞(bao)和死(si)細胞(bao)濃度。為(wei)了(le)(le)確(que)定濃度的(de)線(xian)性(xing)測量范圍，本實驗制備了(le)(le)一系列稀釋液(ye)。
● 以1,500rpm的轉速(su)將細胞(bao)離心2分鐘來收集BL2細胞(bao)樣品，然后棄去上清(qing)液并(bing)用新鮮的測量緩沖液重(zhong)新懸浮細胞(bao)。
● 之后按1:3、1:9和 1:27稀釋濃度制備(bei)稀釋液，并重復(fu)測量三次。
● 使用Neubauer計數(shu)板(ban)對(dui)1:3稀釋液進行定量(liang)。
一(yi)系列(lie)稀(xi)釋液(ye)的(de)測(ce)(ce)量(liang)結(jie)果顯(xian)示如圖(tu)6A所示，兩種檢測(ce)(ce)方法的(de)計(ji)數結(jie)果顯(xian)示出高(gao)度(du)(du)(du)的(de)線性一(yi)致性。然而高(gao)濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)細(xi)胞(bao)（> 2×106個cells/ml）會導致Ampha Z32的(de)阻(zu)抗信號(hao)重疊，這(zhe)是由于高(gao)濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)下，多(duo)個細(xi)胞(bao)容(rong)易(yi)緊密通(tong)過或重合(he)通(tong)過微流控芯(xin)片（圖(tu)5C），這(zhe)將(jiang)導致細(xi)胞(bao)濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)被(bei)低估。此時(shi)可使(shi)用測(ce)(ce)量(liang)緩沖液(ye)調整稀(xi)釋倍數，使(shi)樣品(pin)濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)達(da)到(dao)合(he)適的(de)測(ce)(ce)定范圍。圖(tu)5B中的(de)結(jie)果表明Ampha Z32活力(li)測(ce)(ce)定結(jie)果的(de)可重復(fu)性極高(gao)，且不受(shou)細(xi)胞(bao)濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)影響。
圖(tu)6 Ampha Z32測試的合(he)理(li)濃度范圍
A) IFC法與(yu)Neubauer計數板的(de)相關性(xing)分(fen)析（n=3，sd=±3%）；B) 不同稀釋倍(bei)數下(xia)的(de)細(xi)胞(bao)活力，細(xi)胞(bao)活力不受細(xi)胞(bao)濃(nong)度的(de)影響（非配對(dui)t檢驗，p>0.05）;C) 原(yuan)始樣品和(he)按1:27稀釋后，細(xi)胞(bao)阻抗(kang)信號(hao)(hao)(hao)示例（2MHz頻率下(xia)）。高濃(nong)度原(yuan)始樣本出現(xian)干擾信號(hao)(hao)(hao)（最左邊的(de)信號(hao)(hao)(hao)）和(he)雙(shuang)峰信號(hao)(hao)(hao)（虛線框），這是(shi)由于細(xi)胞(bao)緊密(mi)通(tong)過或重(zhong)合通(tong)過微流控芯片(pian)。相比(bi)之下(xia)，1:27稀釋后的(de)樣品具(ju)有(you)更明顯和(he)離散的(de)粒子(zi)信號(hao)(hao)(hao)。
BL2細胞的凋亡過程
Staurosporine是一種(zhong)蛋白激酶抑制劑(ji)和細(xi)(xi)胞凋亡誘(you)導劑(ji)。圖7顯示在Staurosporine誘(you)導下，BL2活細(xi)(xi)胞群的阻抗信(xin)號變化(hua)（相移(yi)），直到細(xi)(xi)胞全部死亡。
從該(gai)誘(you)導過(guo)程（圖7）以及(ji)培養過(guo)程（圖4A）中細(xi)(xi)(xi)胞(bao)阻抗信號(hao)的(de)變化(hua)可(ke)以發現(xian)，在整個細(xi)(xi)(xi)胞(bao)凋亡過(guo)程中，細(xi)(xi)(xi)胞(bao)從高相(xiang)位(wei)(wei)角（≈325°，活細(xi)(xi)(xi)胞(bao)和(he)增殖細(xi)(xi)(xi)胞(bao)）經中間過(guo)渡狀態（細(xi)(xi)(xi)胞(bao)凋亡）到低(di)相(xiang)位(wei)(wei)角（≈235°，死細(xi)(xi)(xi)胞(bao)）。因此，相(xiang)位(wei)(wei)角可(ke)以作為指示細(xi)(xi)(xi)胞(bao)狀態的(de)一個有效指標。
圖7 Staurosporine誘導(dao)下BL2細胞的凋亡過程(cheng)
A）Staurosporine誘導后，BL2細胞相位直方圖隨時間的變化。活細胞群在誘導初期(t<10min)快速發生相移，之后穩步發生變化，直到細胞開始死亡(t>1.5h)。該相位直方圖10MHz電場頻率下獲得。B）Staurosporine誘導的50個小時內，BL2細胞活力的變化過程。從圖中可以看出，接觸Staurosporine誘導1.5h后，BL2細胞的活力迅速下降，此時對照組（DMSO誘導）BL2細胞仍處于生長狀態。18h后，對照組BL2細胞活力才開始降低。
結論
本次(ci)實(shi)(shi)驗結(jie)果(guo)表明，Ampha Z32阻(zu)抗(kang)流式細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)儀是一(yi)種(zhong)在(zai)單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)水平(ping)上測(ce)(ce)量(liang)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)電特性(xing)的(de)(de)(de)強大的(de)(de)(de)無標記檢測(ce)(ce)方法，并可以>1,000個(ge)Cells/s的(de)(de)(de)采集(ji)速率(lv)實(shi)(shi)現(xian)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)高通(tong)量(liang)檢測(ce)(ce)。每(mei)個(ge)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)測(ce)(ce)量(liang)阻(zu)抗(kang)數據實(shi)(shi)時顯(xian)示在(zai)相位-振幅(fu)散(san)點(dian)圖中，測(ce)(ce)量(liang)結(jie)束(shu)后(hou)可以快速識別和量(liang)化活(huo)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)和死細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，并獲得各自的(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)濃度。此外，根據阻(zu)抗(kang)相位的(de)(de)(de)變(bian)化還可準確預判細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)狀態，即(ji)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)存(cun)活(huo)、凋(diao)亡(wang)或(huo)死亡(wang)。
因此，我們認為Ampha Z32阻抗流式細胞儀（IFC）是一種可以無標記、快速表征細胞狀態的檢測技術，在監測細胞培養物的濃度和活力、對凋亡誘導劑、細胞毒劑或其他試劑的劑量反應或反映進程中有著廣闊的應用前景。
相關閱讀：