不結球白菜生長發育過程中表型變化雙(shuang)單倍體（Doubled Haploid）育(yu)種(zhong)(zhong)(zhong)，簡稱(cheng)DH育(yu)種(zhong)(zhong)(zhong)，是利用誘(you)導(dao)系誘(you)導(dao)（或(huo)花(hua)藥(yao)離體培養等(deng)手(shou)段誘(you)導(dao)）產(chan)生單倍體植株(zhu)，再(zai)通過染(ran)色體組加倍（自然加倍或(huo)藥(yao)劑處(chu)理）使植物恢復正常染(ran)色體數(shu)的育(yu)種(zhong)(zhong)(zhong)方法。DH育(yu)種(zhong)(zhong)(zhong)能夠(gou)在較短(duan)時間（2代）內便可(ke)以選育(yu)出DH純系，大(da)大(da)縮短(duan)育(yu)種(zhong)(zhong)(zhong)年限(xian)，是加速種(zhong)(zhong)(zhong)質材料(liao)純化、縮短(duan)育(yu)種(zhong)(zhong)(zhong)年限(xian)的有(you)效途(tu)徑，是現代生物技(ji)術育(yu)種(zhong)(zhong)(zhong)的主要支柱技(ji)術之一。
由于自然單性(xing)生殖或孤(gu)雄生殖單倍(bei)體非常(chang)罕(han)見，因此(ci)單倍(bei)體的(de)獲得(de)成(cheng)為單倍(bei)體育(yu)種的(de)一個(ge)難點，游離(li)小(xiao)孢(bao)子(zi)培(pei)養是(shi)獲得(de)單倍(bei)體的(de)重要手段之一。植(zhi)物游離(li)小(xiao)孢(bao)子(zi)培(pei)養受(shou)外植(zhi)體預(yu)處理(li)、小(xiao)孢(bao)子(zi)預(yu)處理(li)、供(gong)體基(ji)因型、小(xiao)孢(bao)子(zi)培(pei)養密(mi)度、培(pei)養基(ji)pH值和(he)培(pei)養基(ji)成(cheng)分等因素的(de)共同影(ying)響，因此(ci)無法形成(cheng)通用的(de)誘導(dao)策略，需要從花芽選取(qu)、小(xiao)孢(bao)子(zi)胚誘導(dao)、二(er)倍(bei)體化等各(ge)個(ge)環(huan)節進行不(bu)斷的(de)調整和(he)改善，才能構建一種植(zhi)物優選的(de)游離(li)小(xiao)孢(bao)子(zi)培(pei)養體系。
本文利用(yong)Ampha Z32花粉(fen)活力分析儀(yi)（阻抗流式細(xi)胞技術，IFC）進行了系列測試，以期(qi)幫助廣(guang)大(da)科研用(yong)戶構建優(you)選的(de)游離(li)小孢子培養(yang)體系，提高游離(li)小孢子的(de)培養(yang)效率(lv)：1）確定小孢子各發育階段的相位角-振幅散點圖，并歸納發育變化軌跡；2）確定培養開始前和整個培養過程中小孢子的活力；3）估算小孢子的密度；4）監測小孢子對誘導策略和培養條件的響應，進行產胚率的早期預測。
—— 小孢子發育階段(duan) ——
小孢(bao)(bao)(bao)子(zi)發(fa)育時(shi)期(qi)(qi)是(shi)影響小孢(bao)(bao)(bao)子(zi)培養(yang)(yang)的(de)關鍵因素(su)之一，選(xuan)擇(ze)合(he)適的(de)花粉發(fa)育時(shi)期(qi)(qi)可(ke)極(ji)大(da)的(de)提高植株小孢(bao)(bao)(bao)子(zi)胚狀體(ti)發(fa)生(sheng)的(de)誘導效率。大(da)量研究表(biao)明，通常小孢(bao)(bao)(bao)子(zi)培養(yang)(yang)的(de)最佳時(shi)期(qi)(qi)是(shi)單核晚(wan)期(qi)(qi)（單核靠邊期(qi)(qi)）和(he)雙核早期(qi)(qi)，這可(ke)能是(shi)由于(yu)單核靠邊期(qi)(qi)的(de)小孢(bao)(bao)(bao)子(zi)處于(yu)面臨不同分(fen)裂方式和(he)發(fa)育途徑的(de)敏感時(shi)期(qi)(qi)，更容易誘導成(cheng)功。因此，準確判斷并選(xuan)擇(ze)最適時(shi)期(qi)(qi)的(de)小孢(bao)(bao)(bao)子(zi)進行培養(yang)(yang)，是(shi)提高產胚量的(de)基(ji)本(ben)保(bao)障。
傳統(tong)上進行(xing)(xing)小(xiao)孢子發育(yu)階段的鑒定是通過染(ran)色鏡檢(jian)法，即用DAPI或乙酰(xian)胭脂紅對采自不(bu)同大小(xiao)花蕾或穗的小(xiao)孢子進行(xing)(xing)染(ran)色，然后(hou)顯微鏡觀察(cha)細胞(bao)核的數(shu)目(mu)和形態，并計數(shu)以確定各發育(yu)階段細胞(bao)所(suo)占(zhan)的比例(li)，此過程極(ji)其費時、耗力。
由(you)于處于不(bu)(bu)(bu)同(tong)發(fa)育階(jie)段(duan)的(de)小(xiao)孢(bao)子的(de)體積(ji)、細胞(bao)質(zhi)和細胞(bao)膜(mo)的(de)特性不(bu)(bu)(bu)同(tong)，Ampha Z32花粉(fen)活(huo)力分(fen)析儀(yi)所(suo)檢(jian)測(ce)到的(de)電阻(zu)抗信(xin)號(hao)也就不(bu)(bu)(bu)同(tong)，由(you)此而生成的(de)相(xiang)位角（X-相(xiang)對活(huo)性）-振幅（Y-相(xiang)對大小(xiao)）散點(dian)圖不(bu)(bu)(bu)同(tong)，所(suo)形成的(de)散點(dian)類群也不(bu)(bu)(bu)同(tong)。如圖1所(suo)示，小(xiao)麥孢(bao)子發(fa)育過(guo)程散點(dian)圖的(de)變化以(yi)及DAPI染色法(fa)確定的(de)對應發(fa)育階(jie)段(duan)。本測(ce)試使用AF6緩沖液從單(dan)個小穗(sui)的花(hua)藥中分(fen)離出小孢子，取極小的一部(bu)(bu)分(fen)進(jin)(jin)行(xing)DAPI染色(se)，剩余(yu)部(bu)(bu)分(fen)經過濾稀釋(shi)后(hou)用Ampha Z32花(hua)粉活力分(fen)析儀進(jin)(jin)行(xing)測(ce)量。
圖1 小麥孢子發育變化軌跡
我們測試了多種(zhong)植(zhi)(zhi)物在(zai)不同發育階段(duan)的(de)(de)散(san)點云圖，并(bing)對比(bi)了不同發育階段(duan)散(san)點云變(bian)化(hua)(hua)，結果表明(ming)通過散(san)點圖的(de)(de)變(bian)化(hua)(hua)軌跡(ji)均可以(yi)準確(que)區分(fen)出小(xiao)孢(bao)子的(de)(de)不同發育階段(duan)。如(ru)(ru)圖2所(suo)(suo)示(shi)，不同發育階段(duan)的(de)(de)散(san)點顏色(se)不同，三細(xi)胞花(hua)粉(fen)物種(zhong)（西藍花(hua)、辣椒）成熟軌跡(ji)中(zhong)的(de)(de)散(san)點類群明(ming)顯(xian)多于二細(xi)胞花(hua)粉(fen)物種(zhong)（水稻(dao)）。利用Ampha Soft軟件(jian)的(de)(de)統計分(fen)析(xi)功(gong)能，我們可以(yi)量(liang)化(hua)(hua)每個顏色(se)類群的(de)(de)散(san)點數，即(ji)統計出每個發育階段(duan)的(de)(de)小(xiao)孢(bao)子的(de)(de)數量(liang)及比(bi)例，幫(bang)助確(que)定特(te)定發育階段(duan)占比(bi)較高(gao)的(de)(de)花(hua)芽的(de)(de)大小(xiao)或小(xiao)穗所(suo)(suo)處的(de)(de)位置，如(ru)(ru)圖3所(suo)(suo)示(shi)。小(xiao)孢(bao)子發育階段(duan)的(de)(de)準確(que)判定，為小(xiao)孢(bao)子供體的(de)(de)選擇帶來極(ji)大的(de)(de)便利，可極(ji)大的(de)(de)提高(gao)植(zhi)(zhi)株小(xiao)孢(bao)子胚狀體發生的(de)(de)誘(you)導頻(pin)率。
圖2 小孢子不同發育階段的散點云疊加圖
圖3 麥穗不同穗位的單核、雙核和三核小孢子的比例
盡管同一物種(zhong)的(de)花(hua)粉在發(fa)育的(de)單核(he)早期(qi)(qi)、單核(he)晚期(qi)(qi)及成熟早期(qi)(qi)的(de)相(xiang)位角-振幅散點圖(tu)中具(ju)有相(xiang)似的(de)相(xiang)位角，但振幅大(da)小(xiao)卻可能(neng)差異顯著(zhu)，這是由于遺(yi)傳變異會(hui)影響(xiang)小(xiao)孢子的(de)大(da)小(xiao)，因此(ci)我們(men)建議根據基(ji)因型評估不同花(hua)粉的(de)發(fa)育階段。
—— 小孢子的活力和密度 ——
小(xiao)孢子的活力(li)(li)和密度亦(yi)是影響小(xiao)孢子胚(pei)狀體產生的主要因素。本實驗利用(yong)Ampha Z32花粉活力(li)(li)分析儀(yi)對這(zhe)兩個指(zhi)標進行了(le)測試，同時(shi)利用(yong)FDA染色法(fa)測試細胞(bao)活力(li)(li)，利用(yong)血球計數器進行細胞(bao)計數。
Ampha Z32花(hua)(hua)粉(fen)活(huo)(huo)力分析儀(yi)（Amphasys，瑞士(shi)），通(tong)過檢測(ce)流經交流電(dian)場的(de)花(hua)(hua)粉(fen)懸浮液(ye)(ye)中(zhong)花(hua)(hua)粉(fen)的(de)電(dian)阻(zu)抗信號(hao)，分析獲(huo)得花(hua)(hua)粉(fen)的(de)數量(liang)、大小(xiao)、活(huo)(huo)性，測(ce)量(liang)過程中(zhong)確(que)保懸浮液(ye)(ye)介質電(dian)導率的(de)穩定(ding)對準(zhun)確(que)評(ping)估(gu)花(hua)(hua)粉(fen)活(huo)(huo)性是非常(chang)重要的(de)。大量(liang)實(shi)驗表(biao)明，緩沖(chong)液(ye)(ye)（AmphaFluid）體(ti)積(ji)占比(bi)達到50-80%，才(cai)能較(jiao)好的(de)評(ping)估(gu)小(xiao)孢子的(de)活(huo)(huo)性，由于不(bu)同培養(yang)介質的(de)電(dian)導率不(bu)同，建議通(tong)過多次實(shi)驗確(que)定(ding)小(xiao)孢子培養(yang)液(ye)(ye)和緩沖(chong)液(ye)(ye)（AmphaFluid）的(de)較(jiao)優體(ti)積(ji)比(bi)。移取精確(que)體(ti)積的(de)小孢子混合液后(hou)，在Ampha Z32花粉活(huo)力分析儀的(de)計數(shu)模式下進(jin)行測量(liang)即可確(que)定小孢子的(de)準確(que)濃(nong)度，并統計出活(huo)性小孢子的(de)數(shu)量(liang)，整個測試過程(cheng)不超過2min。
圖(tu)4 南(nan)瓜(gua)小孢子散點圖(tu)
—— 誘(you)導成功率評估及產胚量的早(zao)期(qi)預測 ——
法國Vegenov研究所利用AmphaZ32花粉活力分析儀追蹤了小麥小孢子的發育過程（案例介紹：Ampha Z32在小麥孢(bao)子發育及產(chan)胚量早期預(yu)測(ce)中的應用）。實驗(yan)結果(guo)顯(xian)示，經誘導處理后，大(da)部分小(xiao)麥小(xiao)孢(bao)子(zi)在培養的幾天內就停止了發育，只有(you)一小(xiao)部分活細胞能(neng)逐漸分裂成(cheng)星形小(xiao)孢(bao)子(zi)，最后形成(cheng)有(you)組(zu)織結構(gou)的胚狀體。
Vegenov的(de)(de)研究發現(xian)，IFC信號(hao)隨小麥小孢(bao)子(zi)(zi)形(xing)態、細胞(bao)(bao)大小的(de)(de)變化(hua)而(er)(er)變化(hua)，結合(he)顯微鏡鏡檢（圖(tu)5），可(ke)(ke)以準確(que)(que)匹配到(dao)小孢(bao)子(zi)(zi)發育的(de)(de)不(bu)(bu)同階(jie)段。從IFC信號(hao)所確(que)(que)定(ding)(ding)的(de)(de)相(xiang)位(wei)(wei)角(jiao)-振幅散點圖(tu)中可(ke)(ke)利用多邊形(xing)門(men)控區分(fen)出(chu)處(chu)(chu)于不(bu)(bu)同發育狀態的(de)(de)小孢(bao)子(zi)(zi)類(lei)(lei)(lei)(lei)群(qun)，如(ru)圖(tu)6所示。其(qi)中小孢(bao)子(zi)(zi)經過(guo)脅(xie)迫(po)處(chu)(chu)理(li)后(hou)（D0），相(xiang)位(wei)(wei)角(jiao)-振幅散點圖(tu)中出(chu)現(xian)的(de)(de)P2細胞(bao)(bao)類(lei)(lei)(lei)(lei)群(qun)為具有(you)(you)活性的(de)(de)小孢(bao)子(zi)(zi)群(qun)，后(hou)續實(shi)驗(yan)證明(ming)，這一類(lei)(lei)(lei)(lei)群(qun)反(fan)映了小麥小孢(bao)子(zi)(zi)對誘導處(chu)(chu)理(li)的(de)(de)響應，可(ke)(ke)幫(bang)助在(zai)(zai)小孢(bao)子(zi)(zi)培(pei)(pei)養前確(que)(que)定(ding)(ding)誘導處(chu)(chu)理(li)的(de)(de)效果，提高胚狀體發生(sheng)的(de)(de)成功率。而(er)(er)培(pei)(pei)養開始后(hou)出(chu)現(xian)的(de)(de)P3細胞(bao)(bao)類(lei)(lei)(lei)(lei)群(qun)，與花粉發育（配子(zi)(zi)體發育途徑(jing)）過(guo)程中發現(xian)的(de)(de)任何細胞(bao)(bao)類(lei)(lei)(lei)(lei)群(qun)都(dou)不(bu)(bu)重疊，這表(biao)明(ming)該類(lei)(lei)(lei)(lei)群(qun)是孢(bao)子(zi)(zi)體發育途徑(jing)中特有(you)(you)的(de)(de)細胞(bao)(bao)類(lei)(lei)(lei)(lei)群(qun)。培(pei)(pei)養過(guo)程中，該類(lei)(lei)(lei)(lei)群(qun)細胞(bao)(bao)數量逐漸減少，振幅和相(xiang)位(wei)(wei)逐漸增大，說明(ming)部分(fen)小孢(bao)子(zi)(zi)在(zai)(zai)這一過(guo)程中死(si)亡，而(er)(er)部分(fen)小孢(bao)子(zi)(zi)胚在(zai)(zai)不(bu)(bu)斷生(sheng)長發育。此(ci)外(wai)，本實(shi)驗(yan)還(huan)以IFC測試數據為基(ji)礎，建(jian)立了預(yu)測胚胎(tai)(tai)產(chan)量的(de)(de)線性數學模型，統(tong)計分(fen)析表(biao)明(ming)，培(pei)(pei)養第7天P3類(lei)(lei)(lei)(lei)群(qun)的(de)(de)細胞(bao)(bao)數量可(ke)(ke)以準確(que)(que)預(yu)測30d后(hou)的(de)(de)胚胎(tai)(tai)產(chan)量（y=6.539x-20.827；R^2=0.9519，p <0.05）。
圖5 Pavon小麥(mai)配子體和(he)孢子體途徑的發育(yu)階段
（A）單核(he)小孢(bao)子(zi)(zi)；（B）雙核(he)小孢(bao)子(zi)(zi)；（C）花粉粒；（D）星形(xing)小孢(bao)子(zi)(zi)（v為液(ye)泡(pao)）；（E）多核(he)小孢(bao)子(zi)(zi)；（F）質膜(mo)化(hua)小孢(bao)子(zi)(zi)
圖(tu)6 Pavon小(xiao)麥配子體和孢(bao)子體途徑的發(fa)育階段(duan)（IFC法）
配子(zi)(zi)(zi)體(ti)途徑：ML：單核(he)(he)中晚期(qi)；EB：早期(qi)雙核(he)(he)；LB：單核(he)(he)晚期(qi)；ET：三核(he)(he)早期(qi)；LT：三核(he)(he)晚期(qi)。孢子(zi)(zi)(zi)體(ti)途徑：培(pei)養前21天、培(pei)養第(di)0、1、5和7天的(de)小(xiao)孢子(zi)(zi)(zi)發育(yu)(yu)狀(zhuang)態。ML/D-21代(dai)表配子(zi)(zi)(zi)體(ti)發育(yu)(yu)和孢子(zi)(zi)(zi)體(ti)發育(yu)(yu)的(de)共(gong)同(tong)階段，紅色垂直門控右側為(wei)活(huo)性(xing)細胞，藍色多邊(bian)形門控P1為(wei)雄核(he)(he)發育(yu)(yu)開始時的(de)活(huo)性(xing)孢子(zi)(zi)(zi)群；綠色多邊(bian)形門控P2為(wei)脅(xie)迫處(chu)理后，孢子(zi)(zi)(zi)離體(ti)培(pei)養前（D0）的(de)活(huo)性(xing)孢子(zi)(zi)(zi)群；紫色多邊(bian)形門控P3為(wei)離體(ti)培(pei)養1天后的(de)活(huo)性(xing)孢子(zi)(zi)(zi)群。
以上結果表明，IFC法可(ke)以在DH育種過程中，幫(bang)助選(xuan)擇(ze)小孢(bao)子(zi)植物供體(ti)，評估小孢(bao)子(zi)胚誘導策略(lve)，優(you)化培養條件(jian)，并(bing)在小孢(bao)子(zi)培養早期進行產(chan)胚量(liang)的準確預測，可(ke)顯著提高游離小孢(bao)子(zi)培養的成功率，進而加快DH育種的效率。
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