孢子萌發對于細菌定殖是必要的第一步，孢子在結腸中的萌發速率依賴于宿主菌群的組成，宿主菌群可調控初級及次級膽鹽水平以控制艱難梭菌的孢子萌發。Biosensors and Bioelectronics上發表了一項最新研究，基于萌發的孢子有著更高的凈電導率這一特征，開發了一種基于阻抗檢測的高通量單細胞計數法（Ampha Z32阻抗流式細胞儀，瑞士Amphasys），僅需4小時（傳統方法需24小時）即可評估艱難梭菌的孢子萌發情況，并可用于評估宿主菌群對艱難梭菌感染的易感性。
① 利用高通量單(dan)細胞阻抗(kang)計數法（>300 events/s）對(dui)活細菌(jun)細胞進行定(ding)量；
② 相比于傳統的菌(jun)落(luo)分析(xi)方(fang)(fang)法（需(xu)24h），該(gai)方(fang)(fang)法僅需(xu)培養4h即(ji)可評估孢子萌(meng)發情(qing)況，檢(jian)測下限為每(mei)50μL樣本(ben)中約100個活(huo)細胞(bao)；
③ 萌發的(de)艱難梭菌孢子有更高的(de)凈電導(dao)率，這在中等導(dao)電介質（0.8S/m）內(nei)造(zao)成(cheng)了獨特的(de)高頻（10 MHz）阻抗(kang)相分散（活細(xi)胞與失活細(xi)胞離散）；
④ 該方法(fa)可(ke)對比在不(bu)同的初(chu)級膽鹽水(shui)平(ping)下的艱(jian)(jian)難梭菌孢子萌發速率，并可(ke)用于評估宿主(zhu)對艱(jian)(jian)難梭菌感染的易感性(xing)。
圖(tu)1（a） 艱(jian)難梭菌(jun)(jun)孢子(zi)(zi)萌(meng)發到其營養(yang)體形式受(shou)到“正常(chang)”菌(jun)(jun)群中(zhong)共(gong)生(sheng)細(xi)(xi)菌(jun)(jun)的(de)抑制，該菌(jun)(jun)群分(fen)泌水(shui)解酶(mei)，能夠(gou)代謝初(chu)級(ji)膽鹽為次級(ji)膽鹽，而缺乏共(gong)生(sheng)細(xi)(xi)菌(jun)(jun)的(de)抗(kang)生(sheng)素破壞(huai)菌(jun)(jun)群表(biao)現出較高的(de)初(chu)級(ji)至次級(ji)膽鹽水(shui)平(ping)，導致(zhi)孢子(zi)(zi)萌(meng)發增強；（b） 整體實驗時間表(biao)：包括孢子(zi)(zi)預處理、細(xi)(xi)菌(jun)(jun)生(sheng)長、IFC（阻抗(kang)流(liu)式細(xi)(xi)胞(bao)儀）微流(liu)控表(biao)型分(fen)析(xi)和菌(jun)(jun)群驗證；（c）阻抗(kang)式細(xi)(xi)胞(bao)儀分(fen)析(xi)的(de)具體樣(yang)(yang)品制備(bei)步(bu)驟；（d） 來自抗(kang)生(sheng)素處理的(de)小鼠(shu)模(mo)型的(de)宿主菌(jun)(jun)群樣(yang)(yang)本的(de)采集、制備(bei)和分(fen)析(xi)步(bu)驟。圖2 艱難梭菌UK1孢子在不(bu)同(tong)水(shui)平牛(niu)磺膽酸鹽的標準生(sheng)長培(pei)養(yang)基中培(pei)養(yang)后的微生(sheng)物學分析圖2（a） 24小(xiao)時內的(de)(de)生長(chang)曲線(xian)顯(xian)示，隨著牛(niu)磺(huang)膽(dan)酸鹽水平(ping)(ping)的(de)(de)增加，孢子(zi)(zi)萌(meng)發(fa)率逐漸(jian)提(ti)高(gao)，由于營養性艱(jian)難梭(suo)菌的(de)(de)存(cun)在(zai)， 0.001% 、0.01%和(he) 0.1%牛(niu)磺(huang)膽(dan)酸鹽水平(ping)(ping)下的(de)(de)吸(xi)光度(du)分(fen)別在(zai)20h、18h、15h（用(yong)虛線(xian)標記）與(yu)(yu)無牛(niu)磺(huang)膽(dan)酸鹽的(de)(de)對照組的(de)(de)吸(xi)光度(du)相(xiang)比，出現顯(xian)著差異（*p<0.05）；（b） 24小(xiao)時后(hou)的(de)(de)CFU分(fen)析結果(guo)顯(xian)示，含有(you)0.1%牛(niu)磺(huang)膽(dan)酸鹽的(de)(de)生長(chang)培養基的(de)(de)孢子(zi)(zi)萌(meng)發(fa)顯(xian)著（****p<0.0001），而其他牛(niu)磺(huang)膽(dan)酸鹽水平(ping)(ping)下孢子(zi)(zi)萌(meng)發(fa)并不明顯(xian)；（c）培養4小(xiao)時后(hou)的(de)(de)DEP歸一(yi)(yi)化光譜和(he)頻譜結果(guo)顯(xian)示，含有(you)0.1%牛(niu)磺(huang)膽(dan)酸鹽的(de)(de)DEP歸一(yi)(yi)化光譜與(yu)(yu)同質營養體(ti)艱(jian)難梭(suo)菌勻質樣(yang)品(pin)的(de)(de)DEP歸一(yi)(yi)化光譜（實線(xian)）極為相(xiang)似，根據異質樣(yang)本的(de)(de)凈電生理(li)特性可以推斷，在(zai)0.1%牛(niu)磺(huang)膽(dan)酸處理(li)的(de)(de)樣(yang)本中存(cun)在(zai)營養體(ti)艱(jian)難梭(suo)菌亞(ya)群，這與(yu)(yu)傳統法分(fen)析（圖2a和(he)b）的(de)(de)評估結果(guo)一(yi)(yi)致，但檢(jian)測(ce)可在(zai)更(geng)短時間(jian)內進行（4小(xiao)時.VS >15小(xiao)時）。
圖3 營養體(ti)艱難(nan)梭菌細胞和孢子(zi)的(de)多殼(ke)層介電模型(xing)&均(jun)質種群的(de)歸一(yi)化(hua)DEP光譜
圖3（a） 基(ji)于(yu)營(ying)(ying)養(yang)(yang)(yang)體(ti)(ti)細(xi)(xi)胞和(he)孢子(zi)的(de)(de)大小、形狀和(he)結構(gou)差異(yi)，生(sheng)成多殼層介電模型；（b） 營(ying)(ying)養(yang)(yang)(yang)體(ti)(ti)細(xi)(xi)胞和(he)孢子(zi)均質種群的(de)(de)歸一化(hua)DEP光譜結果(guo)表(biao)明(ming)，不同樣(yang)品類型的(de)(de)極化(hua)和(he)電生(sheng)理(li)特性存在(zai)明(ming)顯(xian)差異(yi)。低于(yu)100 kHz的(de)(de)電場頻率下(xia)，營(ying)(ying)養(yang)(yang)(yang)體(ti)(ti)艱難梭菌細(xi)(xi)胞因絕緣(yuan)細(xi)(xi)胞外殼表(biao)現(xian)為nDEP（負DEP），但在(zai)高于(yu)1 MHz的(de)(de)電場頻率下(xia)，營(ying)(ying)養(yang)(yang)(yang)體(ti)(ti)艱難梭菌因細(xi)(xi)胞內部的(de)(de)導電細(xi)(xi)胞質而發生(sheng)極化(hua)，表(biao)現(xian)出pDEP（正DEP）。圖(tu)4 不同(tong)頻率(lv)、介(jie)質電導率(lv)下，艱難梭菌活細胞營(ying)養體與熱(re)滅活后的艱難梭菌細胞的阻抗數據（相位(wei)-振幅）疊加(jia)圖(tu)（IFC法）由于(yu)孢子(zi)萌發過程(cheng)中(zhong)樣品的(de)(de)異質性，研究可利用Ampha Z32阻抗(kang)流式細(xi)胞(bao)(bao)儀（IFC法(fa)）通過檢測營(ying)養體艱(jian)(jian)難(nan)梭(suo)菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)電(dian)生(sheng)理學特征(zheng)來鑒定孢子(zi)萌發，并量(liang)化營(ying)養體艱(jian)(jian)難(nan)梭(suo)菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)比(bi)例。圖4為(wei)(wei)不(bu)同頻(pin)率（0.5 MHz (a & d)、2 MHz (b & e)、10 MHz (c & f)）、不(bu)同介質導電(dian)條件（0.5× PBS（a-c）、1× PBS（d–f) ）下(xia)，艱(jian)(jian)難(nan)梭(suo)菌(jun)(jun)(jun)活細(xi)胞(bao)(bao)營(ying)養體與熱滅活后的(de)(de)艱(jian)(jian)難(nan)梭(suo)菌(jun)(jun)(jun)細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)阻抗(kang)數據（相位-振幅(fu)）疊加圖。對比(bi)可知，0.5× PBS（介質電(dian)導率為(wei)(wei) 0.8 S/m），10 MHz 下(xia)二(er)者的(de)(de)區分(fen)度最(zui)佳，篩選門(men)控可設于(yu)218°相位處(chu)（圖4c實線），此時艱(jian)(jian)難(nan)梭(suo)菌(jun)(jun)(jun)活細(xi)胞(bao)(bao)占比(bi)＞95%。圖5 不(bu)同牛(niu)磺膽酸鹽水平(ping)、不(bu)同培(pei)養時間下艱難梭菌(jun)活細胞的占比（IFC法：0.5× PBS，10 MHz）圖5顯示(shi)孢子(zi)萌發(fa)率(lv)隨(sui)生長培(pei)養(yang)基中(zhong)牛磺膽(dan)酸鹽水平以(yi)及(ji)萌發(fa)時(shi)間的(de)(de)增加而增加，其中(zhong)0.1% 牛磺膽(dan)酸鹽的(de)(de)生長培(pei)養(yang)基中(zhong)培(pei)養(yang) 4 小時(shi)后(hou)(hou)，孢子(zi)萌發(fa)率(lv)約為 30%（每50μL 樣品(pin)約 250 個營養(yang)體艱(jian)難梭菌細(xi)胞），而0.05–0.1%牛磺膽(dan)酸鹽的(de)(de)生長培(pei)養(yang)基中(zhong)萌發(fa) 5 小時(shi)后(hou)(hou)，孢子(zi)的(de)(de)萌發(fa)率(lv)可達80%以(yi)上(shang)；該測(ce)定結果表(biao)明艱(jian)難梭菌對培(pei)養(yang)時(shi)間和(he)生長培(pei)養(yang)基中(zhong)初級膽(dan)汁(zhi)鹽（牛磺膽(dan)酸鹽）比例的(de)(de)變化表(biao)現出良(liang)好的(de)(de)敏感性。圖6 未處理和(he)抗(kang)生素處理的艱難(nan)梭菌(jun)孢子萌發實(shi)驗比(bi)較(jiao)（宿(su)主菌(jun)體外菌(jun)群）本研(yan)究(jiu)使(shi)用從小鼠(shu)模型獲(huo)得的(de)(de)(de)(de)體(ti)外菌(jun)(jun)群樣(yang)品進一步(bu)驗證了實驗結(jie)果的(de)(de)(de)(de)可靠性(xing)。在(zai)使(shi)用克林(lin)(lin)霉(mei)素(su)進行抗生素(su)治療10天后，按照(zhao)圖1d的(de)(de)(de)(de)步(bu)驟進行了艱(jian)難(nan)梭菌(jun)(jun)孢子(zi)(zi)萌發(fa)實驗。CFU分析（圖6a）結(jie)果顯示，未經處(chu)(chu)理的(de)(de)(de)(de)菌(jun)(jun)群的(de)(de)(de)(de)孢子(zi)(zi)發(fa)芽率明(ming)顯較低，而克林(lin)(lin)霉(mei)素(su)處(chu)(chu)理的(de)(de)(de)(de)菌(jun)(jun)群培(pei)(pei)養(yang)24小時(shi)(shi)后，孢子(zi)(zi)萌發(fa)水平(ping)顯著提高(gao)（**p<0.01），表明(ming)抗生素(su)處(chu)(chu)理后菌(jun)(jun)群多(duo)樣(yang)性(xing)的(de)(de)(de)(de)減少可能會(hui)提高(gao)艱(jian)難(nan)梭菌(jun)(jun)的(de)(de)(de)(de)萌發(fa)率，這(zhe)與此前的(de)(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)結(jie)果一致。而使(shi)用阻(zu)抗流式細胞儀（IFC法）在(zai)培(pei)(pei)養(yang)4小時(shi)(shi)后即(ji)可檢測出(chu)未處(chu)(chu)理和(he)抗生素(su)處(chu)(chu)理的(de)(de)(de)(de)艱(jian)難(nan)梭菌(jun)(jun)孢子(zi)(zi)萌發(fa)率（***p<0.001，圖6b）和(he)孢子(zi)(zi)數量（**p<0.01，圖6c）上(shang)的(de)(de)(de)(de)顯著差(cha)(cha)異(yi)。這(zhe)表明(ming)與CFU法相比，IFC法具有更高(gao)的(de)(de)(de)(de)靈敏(min)性(xing)，可以更早檢測出(chu)宿主菌(jun)(jun)群對艱(jian)難(nan)梭菌(jun)(jun)孢子(zi)(zi)萌發(fa)的(de)(de)(de)(de)敏(min)感性(xing)差(cha)(cha)異(yi)（4h與 24 h）。綜上所述，Ampha Z32阻抗流式細胞儀（IFC法）可用于識別艱難梭菌營養體，量化宿主菌群對艱難梭菌孢子萌發率的影響，并在較短時間內檢測出宿主菌群對艱難梭菌孢子萌發的敏感性差異。該方法檢測靈敏度高、測量快速、樣品制備簡單，有潛力進一步用于CDI臨床測量的基準測試，調查抗生素治療下腸道菌群隨時間變化的敏感性差異，并通過初始和復發艱難梭菌感染的易感性指導臨床管理決策。John H. Moore et al. Quantifying bacterial spore germination by single-cell impedance cytometryfor assessment of host microbiota susceptibility to Clostridioides difficileinfection. Biosensors and Bioelectronics, Volume 166, 2020, 112440, ISSN0956-5663.
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